Рентгено-структурний аналіз

Головною технікою, що дозволяє встановити просторову структуру макромолекули з роздільною здатністю до кількох ангстремів, є рентгено-структурний аналіз. Об'єктом аналізу є кристал, у складі якого однакові макромолекули чи макромолекулярні комплекси утворюють впорядковану тривимірну решітку. Кристали, придатні для рентгеноструктурного аналізу (розміром принаймні 0,3 мм), готують з перенасичених розчинів макромолекул, контролюючи швидкість зростання кристалу за рахунок варіювання концентрації солі, температури, додаючи органічні розчинники тощо. У кристалах білків та нуклеїнових кислот, як правило, залишається значна кількість впорядкованих молекул води.

Вузький рентгенівський промінь буде частково розсіюватись на атомах кристалу. Оскільки групи атомів періодично повторюються в кристалі, розсіяні промені будуть інтерферувати між собою, підсилюючи один одного у певних точках на детекторі, що реєструє рентгенівські промені після їх проходження крізь зразок. У результаті на детекторі формується впорядкований розподіл так званих рефлексів – точок високої інтенсивності.

Картина рентгенівського розсіювання містить інформацію щодо просторових позицій атомів у кристалі. Вилучення цієї інформації є досить складним математичним завданням, хоча сьогодні комп'ютерна техніка дозволяє аналізувати рентгенограми досить швидко: лімітуючим кроком рентгено-структурного аналізу є, практично, приготування кристалів. Безпосереднім результатом аналізу рентгенограми є складна тривимірна карта електронної щільності. Інтерпретація цієї карти є можливою за умови, якщо послідовність біополімеру в складі кристалу є відомою. Шляхом численних підгонок на комп'ютері ця послідовність (чи послідовності кількох елементів досліджуваного комплексу) узгоджується з електронною картою, результатом чого є встановлення просторової координати кожного атома в макромолекулі. Саме таким шляхом отримано інформацію про структуру численних білків та міжмолекулярних комплексів, частина яких зображена на рисунках цієї книги.

Проте, як правило, великі макромолекули виявляються надто складними для того, щоб рентгенівське розсіювання на їх кристалах дозволило отримати тривимірну структуру. Для визначення структури більшості білків, нуклеїнових кислот та комплексів використовується метод ізоморфних похідних, який потребує набору кристалів макромолекули: вихідний кристал та принаймні 2-3 кристали, що були б ідентичними, але містили б атоми важких металів, що значно більш інтенсивно розсіюють рентгенівське світло. Важкі атоми вводять до кристалу або шляхом дифузії важких металів у кристал, або використовуючи мутантні форми білка. В останньому випадку методами спрямованого мутагенезу здійснюють заміну однієї амінокислоти на Cys, до SH-групи якого можна легко приєднати атом важкого металу. Таким чином, розвиток методів рекомбінантної ДНК та експресії рекомбінантних білків став важливою передумовою структурних досліджень: завдяки рекомбінантних технологій стало можливим не тільки отримувати достатню кількість високо-очищених білків, придатних для подальшої кристалізації, а й готувати їх ізоморфні похідні. Порівняння рентгенограм, отриманих від немодифікованого кристалу та його похідних, дозволяє в решті решт розрахувати структуру макромолекули.

Численні експериментальні результати свідчать про те, що структура макромолекули в кристалі, не тільки у своїх головних загальних рисах, а й у багатьох деталях, співпадає зі структурою у розчині. Проте, за рахунок сил кристалічної упаковки, є можливими деякі деформації просторової структури в кристалах. Крім того, кристал дає статичну картину молекулярної структури, не дозволяючи досліджувати конформаційну динаміку макромолекул за умов, що є наближеними до фізіологічних. Тому важливим доповненням до рентгено-структурного аналізу є різноманітні методи дослідження структури макромолекул у розчині.