217

Розділ 11. Методи молекулярної біології

… блоха действительно была на все ноги подкована на настоящие подковы, а Левша доложил, что и это еще не всё удивительное.

Н. Лесков

"Левша"

Клонування, ампліфікація і секвенування ДНК

Клонування днк

Рис. 11.1. Схема організації плазмідного вектора (Ori – ориджин реплікації, amp^r – ген стійкості до ампіциліну).

Перша проблема, що постає перед дослідником – отримати у достатній кількості предмет свого дослідження. Ефективним підходом, що дозволяє розмножити будь-який конкретний фрагмент ДНК, є техніка клонування цієї ДНК у бактеріальних клітинах: фрагмент, що цікавить, вбудовується у ДНК-вектор з утворенням рекомбінантної молекули ДНК, яка вводиться у клітину (так звана трансформація). Далі залишається зачекати зростання бактеріальної культури – бактерія використовується як своєрідний біореактор.

У якості вектора часто використовують бактеріальні плазміди – порівняно невеликі циркулярні молекули ДНК, що існують у клітині незалежно від бактеріальної хромосоми. Основними вимогами до плазміди як вектора є наявність у її складі ориджина реплікації, унікального (одного на плазміду) сайта, що впізнається певною рестриктазою, та гена стійкості до одного з антибіотиків (рис. 11.1).

Рис. 11.2. Виготовлення рекомбінантної ДНК на основі плазмідного вектора.

Рестриктази – специфічні до невеликих елементів послідовності ендонуклеази (див. також розділ 3), що здійснюють розрізання обох ланцюгів ДНК. Назви рестриктаз (існує кілька сотень таких ферментів) утворюються за таким принципом: перша велика літера позначає рід мікроорганізму, дві маленькі – вид, римські цифри та іноді великі літери – порядковий номер рестриктази серед інших рестриктаз даної бактерії. Наприклад, EcoRI – рестриктаза RI із Escherichia coli.

Сайтом рестрикції, що впізнається рестриктазою, є невеликі (4, 6, іноді трохи більше пар основ) паліндромні послідовності (див., наприклад, сайт EcoRI на рис. 11.2). У залежності від типу рестриктази, два розрізи, які вона здійснює, можуть бути розташованими точно один напроти одного в двох ланцюгах, що призводить до утворення так званих тупих (blunt) кінців. Частіше рестриктази залишають взаємно комплементарні 5'-кінцеві одноланцюгові вирости (як на рис. 11.2) – липкі (sticky) кінці.

Із метою створення рекомбінантної ДНК очищену плазміду, яка містить єдиний сайт певної рестриктази, обробляють цією рестриктазою і отримують лінійний вектор з липкими кінцями (рис. 11.2). Далі додають фрагмент ДНК, який було вилучено за допомогою тієї самої рестриктази. За рахунок комплементарної взаємодії між липкими кінцями фрагмента й вектора утворюється циркулярний нековалентний комплекс двох молекул ДНК. Завдяки використання іншого ключового ферменту рекомбінантної технології – ДНК-лігази (див. розділ 9) – полінуклеотидні ланцюги зашиваються. Найбільш зручними є плазмідні вектори, які містять так званий полілінкер – ділянку із певним набором унікальних рестриктних сайтів, що дозволяє підібрати одну з рестриктаз, найбільш придатну для кожного випадку.

Рис. 11.3. Розмноження рекомбінантної плазміди у бактеріальних клітинах.

Трансформація бактеріальних клітин рекомбінантною плазмідою здійснюється, зазвичай, у розчині CaCl₂ або шляхом електропорації (через суспензію клітин проводиться короткий імпульс електричного струму). В обох випадках підвищується проникність клітинної стінки, і рекомбінантна плазміда потрапляє всередину. Зрозуміло, що далеко не всі бактерії отримують плазміду при трансформації. І тут стає у нагоді ген стійкості до антибіотика: достатньо обробити бактеріальну культуру цим антибіотиком, щоб залишити тільки трансформовані клітини. Далі відбувається автономна реплікація плазміди та розмноження самих клітин, що призводить до значного зростання загальної кількості плазмід (рис. 11.3). Клоновані плазміди виділяють з бактеріальної культури, а їх обробка тією самою рестриктазою, що була використана при виготовленні рекомбінантної молекули, дозволяє вирізати з вектора клонований фрагмент ДНК.

Трансформація бактерій плазмідами є тим більш ефективною, чим меншою за розміром є плазміда. Відповідно, існує обмеження у розмірі фрагментів, що їх можна клонувати описаним шляхом – до 10 000 пар основ. Альтернативною, але цілком аналогічною технікою, що дозволяє працювати з фрагментами довжиною ~20 000 пар основ, є клонування ДНК із використання векторів на основі бактеріофага λ (див. розділ 5). За допомогою рестриктази фрагмент ДНК вбудовується у фагову ДНК, додаються порожні фагові оболонки, і здійснюється збірка фагових частинок in vitro. Рекомбінантними бактеріофагами заражають бактеріальну культуру, де відбувається їх розмноження.

Використовуючи вектори на основі так званих космід, можна клонувати фрагменти ДНК до 40 000 пар основ. Косміда є плазмідою, яка крім ориджину, сайтів рестрикції та генів стійкості до антибіотиків містить два так звані cos-сайти: липкі кінці лінійної молекули ДНК бактеріофага λ. Саме за рахунок cos-сайтів лінійна молекула фагової ДНК циркуляризується після її проникнення у бактеріальну клітину. У лінійну косміду з такими липкими кінцями вбудовується фрагмент ДНК, який бажано клонувати. Рекомбінантна косміда упаковується in vitro у фагові частинки, якими обробляють бактеріальну культуру. Практично, у цьому випадку бактеріофаг використовується як ефективний засіб трансформації: лінійна косміда проникає в клітину, де за рахунок cos-сайтів та бактеріальної лігази циркуляризується. Далі циркулярна косміда розмножується, як звичайна плазміда за схемою на рис. 11.3.