Ініціація реплікації в еукаріотів

Рис. 9.19. Ініціація реплікації в еукаріотів.

Суттєвою відмінністю еукаріотичної системи реплікації є те, що кожна хромосома є полірепліконом: загалом геном, наприклад, ссавців містить близько 40 000 точок ініціації – ориджинів. Ориджини важко ідентифікувати, оскільки спільних елементів послідовності вони не містять, а лише характеризуються підвищеним вмістом АТ-пар. Розмір еукаріотичного реплікона варіює між 50 та 200 kb, що співпадає з розмірами петлевих доменів хроматину (див. розділ 4). Отже, хроматинова петля – це один реплікон, а ориджин співпадає з ділянкою, що асоційована з ядерним матриксом.

Ініціація реплікації залежить від мультибілкового комплексу ORC (Origin Recognition Complex), який практично постійно є присутнім на ориджині (рис. 9.19). При підготовці до реплікації у фазі G1 клітинного циклу відбувається фосфорилювання циклін-залежними кіназами факторів регуляції клітинного циклу cdc6 та cdc45 (cdc – cell division cycle). У результаті ці фактори разом із двома моногексамерами МСМ (яким відводиться роль геліказ) взаємодіють з ORC та індукують локальне плавлення подвійної спіралі. МСМ разом з cdc45 залишаються і далі в основах двох реплікативних вилок. З розплетеними полінуклеотидними ланцюгами взаємодіє RPA, cdc45 рекрутує у кожну реплікативну вилку ДНК-полімеразу α. Остання починає синтез праймера, з основою вилки зв'язується RF-C, який завантажує обруч PCNA, полімераза α замінюється на полімеразу δ/ε (так зване перемикання полімераз). Надалі МСМ продовжує розділення ланцюгів ДНК, а полімераза α здійснює синтез праймерів на ланцюзі, що запізнюється, і кожного разу замінюється на другу копію полімерази δ/ε.

Реплікація ініціюється синхронно на сусідніх 25-100 репліконах, які складають так звану реплікативну фабрику. При цьому різні ділянки хроматину реплікуються не одночасно: в останню чергу відбувається реплікація гетерохроматинових зон.

Структурні зміни хроматину під час реплікації

Рис. 9.20. Руйнування та відновлення нуклеосом у реплікативній вилці.

Зрозуміло, що нуклеосоми (див. розділ 4) є суттєвим бар'єром на шляху реплісоми. Попереду реплікативної вилки відбувається декомпактизація хроматинової фібрили та тимчасове видалення відносно легко взаємодіюючого з ДНК гістона Н1. Нуклеосоми руйнуються у два етапи (рис. 9.20): спочатку видаляється димер гістонів Н2А-Н2В, потім найбільш міцно зв'язаний з ДНК тетрамер (Н3-Н4)₂. Процес видалення гістонових комплексів забезпечується активністю комплексів ремоделювання хроматину (розділ 6) і присутністю проміжних акцепторів гістонів – гістонових шаперонів. Такі шаперони зв'язують гістонові комплекси, що витісняються реплісомою, а потім виконують роль факторів збірки нуклеосом позаду реплікативної вилки. Необхідність факторів збірки нуклеосом визначається надзвичайно високою спорідненістю гістонів до ДНК (див. рис. 4.11).

До найбільш вивчених факторів збірки нуклеосом, що працюють під час реплікації, відносяться, зокрема: NAP1 (Nucleosome Assembly Protein), що має підвищену спорідненість до димерів Н2А-Н2В; CAF1 (Chromatin Assembly Factor) та ASF1 (Anti-Silencing Function), які мають спорідненість до гістонів Н3-Н4 та PCNA, за рахунок чого тетрамери (Н3-Н4)₂ спрямовуються до основи реплікативної вилки (рис. 9.20); RSF (Remodeling and Spacing Factor), який є проміжним акцептором гістонів, а також сприяє регулярному розподілу відновлених нуклеосом на ДНК.

Рис. 9.21. Дві дочірні лінійні молекули ДНК після реплікації.

Відновлення нуклеосом позаду реплікативної вилки відбувається також у дві стадії: першим на ДНК повертається тетрамер (Н3-Н4)₂, який зв'язує два димери Н2А-Н2В. По двом дочірнім ланцюгам ДНК гістонові комплекси розподіляються випадково, до них додаються гістони, синтезовані у цитоплазмі de novo під час реплікації. Таким чином, “старі“ гістони, що несуть на собі певні характерні модифікації (див. розділи 4 та 6), повертаються на ту саму ділянку ДНК обох ланцюгів, на якій вони були присутні на материнській молекулі. До ділянок хроматину рекрутуються відповідні ферменти, які здійснюють аналогічні модифікації щойно синтезованих гістонів – патерн модифікацій відновлюється, що сприяє збереженню певного функціонального стану ділянки хроматину у дочірніх клітинах.