Редагування помилок

Впізнання комплементарної пари основ активним центром ДНК-полімерази перед здійсненням каталізу полімеразної реакції забезпечує частоту помилкового включення нуклеотидів на рівні ~10^–5 (основне джерело помилок – таутомерія азотистих основ, див. рис. 5.11). Оскільки ДНК синтезується “раз і назавжди“ перед її передачею нащадкам, такий рівень помилок не може вважатися задовільним. Відповідно, ДНК-полімерази реалізують ефективний механізм редагування, використовуючи свій 3'-екзонуклеазний активний центр (рис. 9.9).

Рис. 9.9. Редагування помилок: схематичний вид “зверху“ на ДНК-полімеразу (див. рис. 9.5).

Між двома каталітичними центрами, які розташовані на відстані до 30 Å, існує конкуренція за 3'-кінець ланцюга, що синтезується. Якщо внаслідок приєднання помилкового нуклеотида утворилася некомплементарна (нестабільна) пара основ, її спорідненість до полімеразного центра знижується, і 3'-кінець переміщується до екзонуклеазного центра. Подвійна спіраль ДНК при цьому прокручується навкруг своєї осі, зберігаючи взаємодії маленького жолобка з великим пальцем, а ДНК-полімераза залишається у відкритій конформації. Помилковий нуклеотид відщеплюється, в результаті чого відновлюється стабільність кінцевої пари основ. За рахунок більш високої спорідненості стабільної пари до полімеразного центра, 3'-кінець повертається туди, і ДНК-полімераза здійснює нову спробу його подовження.

У результаті такої осциляції полімерази з перемиканням активності між двома центрами рівень помилок знижується до ~10^–10.

Особливості днк-полімерази у порівнянні з рнк-полімеразою

Незважаючи на високу подібність базових механізмів роботи двох типів полімераз, що здійснюють синтез нуклеїнових кислот, існують принципові відмінності між ними. Головна особливість полягає в тому, що для ДНК-полімерази ДНК є одночасно і матрицею, і продуктом реакції, і це створює суттєві проблеми.

Оскільки при синтезі РНК в активному центрі РНК-полімерази тимчасово існує гібридна подвійна спіраль ДНК-РНК (див. розділи 5, 6), РНК-полімераза може легко дискримінувати гібрид від звичайної подвійної спіралі ДНК. Висока спорідненість оточення активного центра РНК-полімерази до гібрида та каналу виходу транскрипта до РНК забезпечує високу процесивність ферменту – здатність працювати без дисоціації після однократного акту ініціації транскрипції. ДНК-полімераза має подвійну спіраль ДНК як в оточенні свого активного центру, так і скрізь поза полімеразним комплексом. Відповідно, існує висока ймовірність її дисоціації: процесивність ДНК-полімерази є дуже низькою – вона може синтезувати до дисоціації лише ділянку довжиною 10-20 нуклеотидів. Отже, має існувати певний додатковий механізм підвищення процесивності ДНК-полімерази.

Висока спорідненість РНК-полімерази до гібрида ДНК-РНК дозволяє легко руйнувати подвійну спіраль ДНК по ходу руху полімерази при елонгації транскрипції – транскрипт просто витісняє нематричний ланцюг ДНК з дуплекса. Для ДНК-полімерази такий механізм є неможливим: дуплекси ДНК у комплексі з полімеразою та попереду від неї нічим не відрізняються один від одного. Тобто, ДНК-полімераза потребує наявності одноланцюгової матричної ДНК, яка має бути вилучена з подвійної спіралі.

Третя проблема полягає у тому, що ДНК-полімераза здатна робити тільки одну операцію – продовжувати (редагуючи) 3'-кінець ланцюга ДНК, вона не може ініціювати синтез, створити перший фосфодіефірний зв'язок. Тобто, певна коротка ділянка має бути створена якось інакше, щоб далі ДНК-полімераза могла продовжувати її синтез. Таку ділянку, без якої неможлива робота ДНК-полімерази, називають праймером (primer). Насправді, кор-фермент РНК-полімерази також не здатен ініціювати синтез РНК: первинний короткий транскрипт синтезується лише за участі факторів ініціації, які допомагають додатково зафіксувати перші нуклеотиди в активному центрі (див. розділи 5, 6). При синтезі ДНК було знайдено інше еволюційне рішення: роль праймера виконує коротка ділянка РНК, що синтезується специфічною ДНК-залежною РНК-полімеразою – праймазою. Використання саме РНК у якості праймера на початку синтезу ДНК має важливе значення для підвищення точності синтезу. Короткі первинні ділянки неможливо синтезувати з дуже високою точністю. На подальших етапах реплікації РНК-праймери можна легко відрізнити від ДНК, вилучити та заповнити прогалини між сусідніми ділянками ДНК за допомогою ДНК-полімерази.

Таким чином, ДНК-полімераза є хоча й головним, але абсолютно не достатнім елементом системи реплікації. У реплікативній вилці працює складний мультибілковий комплекс – реплісома, до якого крім двох молекул ДНК-полімерази входять компоненти, що забезпечують розплітання ДНК, підвищення процесивності та виконують інші важливі допоміжні операції.

Реплісома та інші елементи системи реплікації

Геліказа та білки SSB

Рис. 9.10. Структура реплікативної гелікази (1G8Y).

Операція розплітання подвійної спіралі (тобто, утворення реплікативної вилки) здійснюється ДНК-геліказами – АТР-залежні ферменти цього типу вже згадувались у зв'язку з транскрипцією та сплайсингом (розділи 6, 7).

Основною реплікативною геліказою бактерій є білок Dna B – кільцевий комплекс шести однакових субодиниць (рис. 9.10). У каналі всередині кільця розміщується один полінуклеотидний ланцюг, вздовж якого відбувається транслокація гексамера у напрямку 5'-3' (тобто, по ланцюгу, що запізнюється – рис. 9.11), що й призводить до руйнування подвійної спіралі.

Шість субодиниць гелікази мають сайти зв'язування АТР, де відбувається його гідроліз. Структурні перебудови у відповідь на зв'язування та гідроліз АТР змінюють інтерфейс взаємодії з одноланцюговою ДНК, що й призводить до транслокації – на 3-5 нуклеотидів за один акт гідролізу АТР.

Рис. 9.11. Реплікативна вилка, що виникає як результат дії гелікази та підтримується SSB білками.

Інші реплікативні гелікази побудовані за аналогічними принципами. У розплітанні ДНК під час реплікації приймають також участь гелікази протилежного напряму (3'-5' – транслокація вздовж лідуючого ланцюга), але, на відміну від Dna B, вони не є життєво необхідними. Геліказа Dna B є невід'ємним елементом реплісоми, через інші структурні модулі вона зв'язана з ДНК-полімеразами та працює у тісній координації з ними. Швидкість розплітання ДНК окремою геліказою дорівнює ~35 нуклеотидів за секунду, швидкість руху окремої ДНК-полімерази вздовж одноланцюгової ДНК ~1000 нуклеотидів за секунду, при їх об'єднанні сумісна швидкість реплікації ~750 нуклеотидів за секунду: геліказа трохи гальмує полімеразу, остання – штовхає геліказу.

Енергія гідролізу АТР використовується геліказою для здійснення енергетично невигідного процесу розплітання дуплекса. Тобто, одноланцюгова ДНК, що виникає в реплікативній вилці внаслідок активності гелікази, має бути тимчасово стабілізована в одноланцюговому вигляді. Цю функцію виконують так звані білки SSB (Single Strand Binding), які мають високу спорідненість до одноланцюгової ДНК (рис. 9.11). SSB білки зв'язуються з полінуклеотидним ланцюгом кооперативно, взаємодіючи не тільки з ДНК, а й між собою. У результаті ланцюг ефективно вкривається білковою “шубою“. SSB білки взаємодіють також з іншими компонентами реплісоми, підсилюючи їх активність – в тому числі, активність ДНК-полімерази.