Структура днк-полімерази та полімеразна реакція

Рис. 9.5. Комплекс фрагмента Кленова ДНК-полімерази І із ДНК у полімеразному активному центрі (1L3T).

Структуру основної частини ДНК-полімерази І – так званий фрагмент Кленова (Hans Klenow) – показано на рис. 9.5 (додатковий домен полімерази відповідає за 5'-екзонуклеазну активність). Подібну структуру мають більшість інших про- та еукаріотичних ДНК-полімераз. Полімеразний активний центр розташований у межах так званої долоні (palm) – щілини, яка оточена двома характерними структурними доменами: рухливими пальцями (fingers) та великим пальцем (thumb). Великий палець взаємодіє з маленьким жолобком подвійної спіралі, що утворена матричним ланцюгом та таким, що синтезується. Пальці взаємодіють з матричним ланцюгом, який при цьому трохи вигинається навкруг пальців, експонуючи чергову азотисту основу для взаємодії з NTP. Сайт зв'язування NTP утворюється пальцями, залишками активного центра, нуклеотидом матричного ланцюга та 3'-кінцем ланцюга, що синтезується. Рухливість пальців дозволяє їм існувати в двох конформаціях:

• відкрита передбачає рух полімерази вздовж ДНК та швидкий перебір NTP;

• закрита, коли пальці переміщуються у напрямку до великого пальця, жорстко фіксуючи NTP у активному центрі та забезпечуючи каталіз полімеразної реакції.

Рис. 9.6. Схема ДНК-полімеразної реакції.

Полімеразна реакція (рис. 9.6) передбачає, що ДНК-полімераза має розташувати 3'-кінцеву ОН-групу зростаючого ланцюга в активному центрі, зв'язати NTP, за умови його комплементарності до нуклеотида матричного ланцюга здійснити каталіз синтезу фосфодіефірного зв'язку з одночасним відщепленням пірофосфату.

Рис. 9.7. Елонгаційний цикл ДНК-полімерази.

Рис. 9.8. Нуклеозидтрифосфат (СТР) та іон Mg²⁺ (фіолетовий) в активному центрі ДНК-полімерази (1LV5). Матричний ланцюг синій, зростаючий – червоний.

На першій стадії елонгаційного циклу, таким чином, відбувається зв'язування NTP (рис. 9.7). ДНК-полімераза при цьому реалізує свою відкриту конформацію, яка дозволяє швидку асоціацію/дисоціацію різних нуклеотидів. Якщо нуклеотид виявляється комплементарним до матриці, з парою основ реалізуються численні взаємодії активного центра та його оточення. Це індукує конформаційну зміну в полімеразі (найбільш повільна лімітуюча стадія циклу) з переміщення пальців, наслідком чого є фіксація NTP у активному центрі (рис. 9.8) та нерухомість полімерази відносно ДНК. На третій стадії здійснюється каталіз реакції. Після приєднання нуклеотида відбувається дисоціація пірофосфату та розмикання полімерази. Оскільки утворився новий продовжений 3'-кінець, який має спорідненість до активного центру, на останній стадії здійснюється транслокація – переміщення полімерази у її відкритій формі на один нуклеотид уздовж матриці.

Принципова схема елонгаційного циклу ДНК-полімерази практично не відрізняється від такої РНК-полімерази (див. розділ 5). Механізм каталізу ДНК-полімеразної реакції також є цілком аналогічним: ключову роль у каталізі виконують 2 іони Mg²⁺, що утримуються в активному центрі двома залишками Asp.