178 Розділ 9. Реплікація днк

It has not escaped out notice that the specific base pairing we have postulated immediately suggests a copying mechanism.

J. Watson, F. Crick

Процес подвоєння ДНК – реплікація (replication) – забезпечує відтворення спадкової інформації та передачу її до дочірніх клітин при мітозі та мейозі. Синтез ДНК відбувається при реплікації з використанням обох полінуклеотидних ланцюгів у якості матриць – за так званим напівконсервативним механізмом: дві дочірні молекули-копії містять один материнський ланцюг (що слугував матрицею) і один ланцюг, синтезований de novo. Включення нуклеотидів до ланцюга, що синтезується, детермінується матрицею за принципом комплементарності, і такий механізм реплікації став зрозумілим відразу після того, як Уотсоном та Кріком була сформульована модель подвійної спіралі ДНК.

Зростання ланцюга ДНК відбувається у напрямі від 5' до 3'-кінця. Субстратами реакції є 3'-кінцева ОН-група дезоксирибози зростаючого ланцюга та дезоксирибонуклеозидтрифосфати (dNTP, див. розділ 3). Фермент, що каталізує цю реакцію – ДНК-залежна ДНК-полімераза (DNA dependent DNA Polymerase, DNAP). Синтез ДНК за подібними механізмами здійснюється також при репарації пошкоджень та деяких інших процесах.

Молекулярні механізми реплікації є спільними для усіх живих організмів. На початку розділу буде розглянуто, головним чином, бактеріальну систему реплікації. Далі описано особливості реплікації в еукаріотів, а також процеси синтезу ДНК при репарації.

Реплікон

Рис. 9.1. Реплікативний міхур – дві реплікативні вилки, що переміщуються у протилежних напрямах (ланцюги, що синтезуються, показано тільки для однієї з них).

Реплікація ДНК починається з невеликої ділянки – ориджина (origin), де здійснюється ініціація процесу, головним моментом якої є розходження ланцюгів ДНК. Далі по ходу реплікації такий реплікативний міхур (рис. 9.1) розростається у двох протилежних напрямах. На кожному боці міхура існує так звана реплікативна вилка, у основі якої і відбувається синтез ДНК. Ділянку ДНК, де здійснюється реплікація, що розпочинається з однієї точки, називають репліконом. Бактеріальна хромосома часто містить тільки один ориджин (зокрема, у E. coli) – являє собою єдиний реплікон. У деяких бактерій може бути 2 реплікони на хромосому. Еукаріотична хромосома є полірепліконом – містить велику кількість точок ініціації.

У кожній реплікативній вилці працюють дві молекули ДНК-полімерази, що здійснюють синтез двох полінуклеотидних ланцюгів. Оскільки два ланцюги є антипаралельними (див. розділ 3), і синтез відбувається тільки у напрямі від 5'- до 3'-кінця, синтез тільки одного з ланцюгів може відбуватися (і відбувається) безперервно, починаючись від ориджину (рис. 9.1). Цей ланцюг називають лідуючим (leading strand), його 3'-кінець знаходиться поблизу від основи реплікативної вилки. Синтез іншого ланцюга розпочинається від реплікативної вилки: синтезуються окремі фрагменти – так звані фрагменти Оказакі (Reiji Okazaki), які пізніше з'єднуються між собою (див. нижче).

Рис. 9.2. Реплікація еукаріотичної хромосоми.

Довжина фрагмента Оказакі при реплікації у бактерій дорівнює 1000-2000 нуклеотидів. Для синтезу кожного з фрагментів треба спочатку звільнити відповідний простір на матричному ланцюзі – пересунути реплікативну вилку вперед (рис. 9.1) – відповідно, фрагментарний ланцюг називають ланцюгом, що запізнюється (lagging strand). Середня швидкість реплікації на одну реплікативну вилку становить ~750 нуклеотидів за секунду у бактерій, 60-90 нуклеотидів за секунду в еукаріотів. Синтез бактеріальної хромосоми відбувається за ~50 хвилин, повна реплікація ДНК еукаріотичної клітини – за кілька годин.

Рис. 9.3. Реплікація циркулярної бактеріальної хромосоми.

У більшості репліконів реплікація відбувається так, як зображено на рис. 9.1 – в обох напрямках. Сусідні реплікони еукаріотичної хромосоми в решті решт “зустрічаються“, і в результаті утворюються дві копії ДНК хромосоми (рис. 9.2). Циркулярна бактеріальна хромосома також реплікується у двох напрямках з утворенням ідентичних циркулярних молекул ДНК (рис. 9.3). Аналогічно реплікуються окремі автономні реплікони бактерій – циркулярні плазміди. Для деяких з них реплікація відбувається тільки в одному напрямі: в ориджині формується лише одна реплікативна вилка, яка рухається навкруг кільця до вихідної точки.

Рис. 9.4. Реплікація циркулярної ДНК бактеріофага λ.

Особливий випадок – реплікація циркулярних ДНК за механізмом кільця, що котиться (rolling circle), який реалізується для ДНК бактеріофагів. Один з варіантів такого механізму (для бактеріофага λ) показано на рис. 9.4. В одному з ланцюгів циркулярної ДНК індукується одноланцюговий розріз, 3'-кінець, що утворився, добудовується з використанням інтактного циркулярного ланцюга в якості матриці. Продовження цього процесу створює довгий одноланцюговий 5'-кінцевий хвіст, що складається з тандемних повторів – копій кільцевої молекули. Кожен з цих повторів використовується як матриця для синтезу іншого ланцюга. Після цього лінійні дволанцюгові фрагменти вирізаються та упаковуються до частинок бактеріофага.

ДНК-полімераза

У клітині E. coli працюють ДНК-полімерази трьох типів. Усі вони мають дві ферментативні активності: власне полімеразну, за рахунок якої до 3'-кінця ланцюга, що синтезується, приєднуються нуклеотиди, та 3'-екзонуклеазну, що використовується для редагування помилок – відщеплення помилкових нуклеотидів, щойно приєднаних до 3'-кінця.

• ДНК-полімераза І (або полімераза Корнберга (Arthur Kornberg)) – мономерний білок з мультидоменною структурою. На відміну від інших ДНК-полімераз має також додаткову 5'-екзонуклеазну активність. ДНК-полімераза І використовується як допоміжна полімераза при реплікації (див. нижче) та інших процесах синтезу ДНК.

• ДНК-полімераза ІІ залучена до певних репараційних процесів.

• ДНК-полімераза ІІІ – основна реплікативна полімераза, дві копії якої працюють у реплікативній вилці. Складається з трьох субодиниць: субодиниця α відповідає за полімеразну активність, ε – за 3'-екзонуклеазну, θ виконує структурну роль.