Атенюація

Рис. 5.17. (а): Схема trp-оперона, на якому синтезуються два РНК-продукти в залежності від внутрішньоклітинної концентрації Trp. (б): Лідерна РНК та два варіанти спарювання основ у її складі в залежності від розташування рибосоми.

Із використанням сигналів термінації пов'язана також система атенюації (attenuation – послаблення), яка використовується, зокрема, для регуляції активності триптофанового оперона (trp-оперона) E. coli. Оперон містить 5 структурних генів, що відповідають за синтез амінокислоти Trp, перед ними знаходяться промотор, оператор і лідерна послідовність, з якої розпочинається транскрипція (рис. 5.17, а).

Атенюація використовує ту обставину, що прокаріотична транскрипція тісно пов'язана з трансляцією. Лідерна частина РНК містить стартовий кодон, що впізнається рибосомою, та 4 елементи послідовності: ділянка 1 містить два послідовних триптофанових кодони, ділянки 2-3 та 3-4 є попарно комплементарними одна одній, за ділянкою 4 розташована оліго-U послідовність (рис. 5.17, б). Таким чином, шпилька 3-4, фланкована оліго-U, є сигналом термінації транскрипції. Коли концентрація Trp є низькою (є потреба у Trp, і оперон має бути активним), рибосома зупиняється на триптофанових кодонах ділянки 1 (оскільки відсутня й триптофаніл-тРНК). В цьому випадку утворюється шпилька 2-3 (ділянка 3 не залучається до утворення термінуючої шпильки), і РНК полімераза продовжує синтез повноцінної мРНК. Рибосоми зв'язуються зі стартовими кодонами, що відповідають структурним генам, і синтезуються відповідні білки.

За високого рівня Trp рибосома швидко проходить через ділянку 1 на ділянку 2 і зупиняється на стоп-кодоні. У результаті утворюється шпилька 3-4 – формується сигнал термінації, РНК-полімераза зупиняє транскрипцію після синтезу короткої нефункціональної лідерної РНК.

trp-Оперон знаходиться також під контролем trp-репресора. Аллостеричним регулятором репресора є сам Trp: у комплексі з ним репресор приймає конформаційну форму, що має високу спорідненість до оператора. При зниженні концентрації Trp репресор дисоціює, і ефективність ініціації транскрипції підвищується у ~70 разів. Атенюація є додатковим, менш ефективним механізмом регуляції: ефективність транскрипції підвищується у ~10 разів у відсутності Trp за рахунок атенюації (у присутності Trp ~10% РНК-полімераз долають сигнал термінації й продовжують працювати, у відсутності Trp – практично всі). Таким чином, сумісна дія атенюації та негативного контролю за рахунок репресора дозволяє змінювати активність оперона у ~700 разів у залежності від внутрішньоклітинної концентрації Trp.

Регуляція транскрипції бактеріофага λ

Рис. 5.18. Циркулярна ДНК бактеріофага λ. Стрілочками позначено промотори та напрям транскрипції: зелені – сильні промотори, червоні – такі, що потребують активації.

Після проникнення у бактеріальну клітину лінійна ДНК бактеріофага λ замикається у кільце бактеріальною лігазою (ligase – АТР-залежний фермент, що каталізує утворення фосфодіефірного зв'язку між 5'- та 3'-кінцевими нуклеотидами). Геном фага містить гени, що відповідають за синтез білків головки та хвоста фагової частинки, реплікацію фагової ДНК, лізис бактерії, рекомбінацію (зокрема, вбудовування фагової ДНК у бактеріальний геном), та кілька регуляторних генів, що кодують фактори транскрипції (рис. 5.18).

Існують два шляхи розвитку фага: лізогенія – лінеаризація фагової ДНК, вбудовування її у бактеріальний геном, і блокування більшості генів фага; лізис (після інфекції або шляхом вирізання фагової ДНК з бактеріального генома та її циркуляризації після лізогенії) – активація реплікації фагової ДНК та синтезу білків оболонки, збірка фагових частинок та руйнування клітини.

Ключову роль у виборі одного з двох шляхів виконують два фактори транскрипції: білок Cro і λ-репресор – продукти, відповідно, генів сro і сІ, що знаходяться поруч у фаговому геномі (рис. 5.18, 5.19). Відразу після інфекції РНК-полімераза зв'язується з двома сильними промоторами P_R та P_L (рис. 5.18), з яких відбувається транскрипція у протилежних напрямах на генах сro і N, відповідно. Обидва гени закінчуються термінаторами, але щойно з'являється білок N, він зв'язується з транскриптами, рекрутує декілька бактеріальних білків, і цей комплекс запобігає впізнанню термінаторів (за механізмом антитермінації, див. рис. 5.16, а). РНК-полімераза у цьому випадку продовжує синтезувати поліцистронну мРНК на сІІІ та генах рекомбінації (з промотору P_L) та сІІ, генах реплікації і Q (з промотору P_R). Після цього можливе розгалуження на два альтернативні шляхи (рис. 5.20).

Розглянемо спочатку шлях лізогенії. Продукт гена сІІ – активатор транскрипції, який забезпечує зв'язування РНК-полімерази зі слабким промотором P_RЕ. З цього промотора (у напрямку, протилежному до напрямку транскрипції сro, рис. 5.18) транскрибується ген сІ, внаслідок чого з'являється λ-репресор. Крім того, білок сІІ активує ген інтегрази (знаходиться серед генів рекомбінації) – ферменту, що забезпечує вбудовування фагової ДНК у геном клітини-хазяїна (див. розділ 10). Продукт гена сІІІ захищає білок сІІ від бактеріальних протеаз, тобто підвищує час життя активатора. Отже, за умови високої концентрації сІІ з'являється певна кількість λ-репресора, а фагова ДНК вбудовується інтегразою у бактеріальний геном.

Рис. 5.19. Зона контакту між генами сІ і cro фага λ: промотори генів частково перекривають три оператори O_R 1,2,3, кожен з яких має спорідненість до репресора та білка Cro.

Репресор (гомодимер, N-кінцеві частини обох субодиниць взаємодіють з ДНК – див. рис. 3.12, 3.13, а) має спорідненість до двох наборів операторів. Один з цих наборів, оператори O_R 1,2,3, кожен довжиною 17 пар основ, частково перекриває промотори P_R і P_RM (рис. 5.19). Промотор P_RM є слабким і може використовуватись для транскрипції гена сІ тільки за умови активації. Послідовності операторів є гомологічними одна одній і розрізняються за спорідненістю до репресора – найвищу спорідненість має ділянка O_R 1.

При заповненні цього оператора репресором промотор P_R гена сro й усіх генів праворуч від нього є заблокованим. С-кінцеві частини двох димерів репресора здатні взаємодіяти між собою: при наявності репресора у сайті O_R 1 швидко заповнюється також сайт O_R 2. Інакше кажучи, репресор кооперативно взаємодіє з ділянками O_R 1,2: його зв'язування з ДНК підсилюється білок-білковими взаємодіями між димерами. При заповненні оператора O_R 2 репресор (який є негативним регулятором гена cro) спрацьовує як позитивний регулятор свого власного гена сІ – індукує зв'язування РНК-полімерази з промотором P_RM. Спорідненість репресора до оператора O_R 3 є найнижчою: ця ділянка некооперативно заповнюється при зростанні концентрації репресора, що вимикає ген сІ. Таким чином активність гена сІ і концентрація репресора підтримуються на оптимальному рівні. На стадії лізогенії тільки ген сІ є активним – репресор блокує також промотор P_L (через відповідні оператори О_L), тобто транскрипцію усіх генів ліворуч від N.

Якщо бактерія піддається дії мутагенів, коли виникає ризик загибелі клітини (разом із вбудованою фаговою ДНК), відбувається активація певної бактеріальної протеази, яка розрізає молекулу репресора між її N- та С-кінцевими доменами. Результатом є порушення димеризації мономерів репресора і втрата спорідненості до ДНК. Внаслідок звільнення операторів O_R та O_L РНК-полімераза зв'язується з промоторами P_R та P_L і починає транскрибувати гени cro та N. Тобто знов виникає ситуація, що спостерігається відразу після інфекції – спрацьовують гени реплікації, сІІ і Q. Але при цьому білок сІІ швидко деградується протеазами, не встигаючи активувати синтез репресора. Така сама ситуація (висока активність протеаз) може реалізуватися після інфекції за умови збагачення середовища на харчові ресурси.

Рис. 5.20. Мережа регуляторних взаємодій між продуктами генів фага λ.

Білок Cro (також гомодимер) некооперативно взаємодіє з операторами O_R 1,2,3, спорідненість до яких знижується у порядку 3-2-1. Заповнення O_R 3 білком Cro остаточно вимикає синтез репресора з промотора P_RM. Подальше заповнення операторів при зростанні концентрації Cro вимикає транскрипцію cro і генів праворуч від нього, так само, як і генів ліворуч від N за рахунок зв'язування Cro з операторами O_L. Але головний наслідок активності cro полягає у появі білка Q.

Ще один промотор P_R' є насправді сильним, але відразу за ним розташований термінатор – РНК-полімераза у відсутності Q синтезує з цього промотора короткий нефункціональний транскрипт. Білок Q спрацьовує як антитермінатор (за механізмом, що зображено на рис. 5.16, б), забезпечуючи долання цього бар'єру. У результаті відбувається синтез поліцистронної мРНК на генах лізису та білків оболонки (праворуч від Q), і відбувається лізис клітини з виходом фагових частинок.

Розглянута досить складна система регуляції транскрипції порівняно простого геному бактеріофага λ має дати уявлення про те, наскільки ускладнюється загальна система регуляції транскрипції у бактерій та, тим більше, в еукаріотів. Насправді, складність загальних систем внутрішньоклітинної регуляції, які залежать від тонкого балансу великої кількості різноманітних впливів, залишається дуже далекою від остаточного розуміння.