Елонгація транскрипції

Рис. 5.8. Вихідна конфігурація системи транскрипції на початку елонгаційного циклу.

При елонгації транскрипції РНК-полімераза рухається вздовж матриці разом із розплавленими 12-14 парами основ у транскрипційному міхурі (рис. 5.4, 5.8). При цьому на кожному кроці полімерази одна пара основ руйнується попереду міхура й одна відновлюється позаду. Розділення подвійної спіралі ДНК перед міхуром полегшується так званою G-петлею РНК-полімерази (G-trigger loop, рис. 5.8). У зоні міхура з полімеразою завжди зв'язаний ДНК-РНК гібрид довжиною 8-9 пар основ: 8-9 нуклеотидів на 3'-кінці РНК залучені до утворення подвійної спіралі з матричним ланцюгом, наступні 5-6 нуклеотидів локалізовані у каналі виходу РНК, решта нуклеотидів на 5'-кінці виходять за межі полімеразного комплексу. Розділенню гібрида (та, відповідно, відновленню ДНК-дуплекса) сприяє L-петля (lid loop, рис. 5.8).

Наявність ДНК-РНК гібриду при транскрипції є дуже важливою обставиною. Цей гібрид існує завдяки специфічних взаємодій, які реалізують з ним певні елементи полімерази. Висока спорідненість РНК-полімерази до гібриду забезпечує високу процесивність ферменту – здатність працювати на матриці без дисоціації. Інший фактор підвищення процесивності – взаємодія транскрипту з каналом виходу РНК. Дисоціація полімерази, яка була можливою під час синтезу первинного транскрипту, поки гібрид був недостатньо довгим (абортивна ініціація, див. вище), під час елонгації стає малоймовірною подією.

На рис. 5.8 схематично зображено вихідну конфігурацію системи на початку кожного елонгаційного циклу перед зв'язуванням чергового NTP. Сайт зв'язування формується 3'-кінцевим нуклеотидом РНК, неспареним нуклеотидом матричного ланцюга ДНК (позначеним як і+1), активним центром полімерази та його оточенням, зокрема F-спіраллю (рис. 5.3, 5.8). ОН-група на 3'-кінці РНК фіксується в активному центрі поряд із іоном Mg²⁺ (рис. 5.3, 5.9). NTP потрапляє до сайта зв'язування через вторинний канал разом з другим іоном Mg²⁺.

Перший етап елонгаційного циклу – відбір та зв'язування нуклеозидтрифосфата, яке контролюється матрицею (нуклеотидом і+1). Спорідненість усіх чотирьох типів NTP до РНК-полімерази є досить невисокою, що дозволяє їм здійснювати швидке зв'язування/дисоціацію. Реалізація комплементарних взаємодій NTP із відповідним нуклеотидом матриці (поява нового ліганду в сайті зв'язування – комплементарної нуклеотидної пари) викликає конформаційну зміну із замиканням NTP та жорсткою фіксацією субстратів у активному центрі (рис. 5.9, 5.10).

Другий етап – хімічна реакція приєднання чергового нуклеотида до 3'-кінця транскрипту (рис. 5.9). За умови реалізації комплементарних взаємодій між NTP та нуклеотидом у складі матриці, NTP жорстко фіксується в активному центрі у певній "напруженій" реакційно-здатній конформації, яка може розглядатися як інтермедіат реакції.

Рис. 5.9. Хімічна схема процесу приєднання нуклеотида.

Найбільш важливу роль у фіксації інтермедіата відіграють два іони Mg²⁺ (один утримується в активному центрі завжди, інший, потрапивший туди разом з NTP – тимчасово, через взаємодію з двома з трьох залишків Asp активного центра). Перший іон взаємодіє з α-фосфатом NTP та 3'-ОН групою, забезпечуючи, зокрема, її іонізацію (рис. 5.9). Другий іон стабілізує певну напружену конформацію усіх трьох фосфатних залишків. Спорідненість активного центра до інтермедіата та жорстка фіксація субстратів забезпечує зниження активаційного бар'єру реакції, тобто її каталіз (див. розділ 2). Результатом реакції є подовжений на один нуклеотид 3'-кінець РНК та відщеплений пірофосфат. Крім того, внаслідок реакції змінюється розташування ліганду (3'-кінця) відносно активного центра (рис. 5.9, 5.10).

Рис. 5.10. Послідовність подій в елонгаційному циклі (збільшений фрагмент схеми на рис. 5.8). Показано також альтернативний шлях при редагуванні помилок. Праворуч: енергетичні профілі, що відповідають руху полімерази вперед відносно матриці при елонгації (вверху) та назад при редагуванні (внизу).

Зміна ліганду та дисоціація пірофосфату призводить до "розмикання" структури в зоні активного центра, яке дозволяє рух полімерази. Відбувається третій етап – транслокація у напрямку оптимального розташування подовженого 3'-кінця відносно активного центра (рис. 5.10). Рух полімерази при транслокації відбувається як одномірна дифузія вздовж матриці за рахунок енергії теплових флуктуацій. Тобто, у принципі є можливим як рух "вперед" так і "назад". Пересування полімерази вперед супроводжується руйнуванням однієї нуклеотидної пари в складі РНК-ДНК гібриду та відновленням однієї пари ДНК позаду від транскрипційного міхура. Одночасно руйнується одна пара ДНК попереду від міхура. Якщо взяти до уваги, що на попередньому етапі внаслідок хімічної реакції відбулося утворення пари в гібриді, маємо практично ізоенергетичний процес – дві нуклеотидні пари утворюються замість двох зруйнованих. Аналогічно, пересування полімерази назад буде супроводжуватись руйнуванням пари у гібриді на 3'-кінці РНК (3'-кінцевий нуклеотид при цьому опиняється у вторинному каналі) та пари ДНК позаду від міхура з одночасним утворенням пари ДНК попереду та гібриду позаду.

Різниця між кінцевими результатами двох рухів – у енергії взаємодій РНК-полімерази з нуклеїновими кислотами. У вихідному претранслокаційному стані (положення і+1, рис. 5.10) реалізуються певні нуклеопротеїнові взаємодії, що зумовлює знаходження системи у локальному мінімумі вільної енергії. З двох інших локальних мінімумів, що відповідають положенням і та і+2, другий є більш глибоким, оскільки для нього реалізуються найбільш сприятливі взаємодії між активним центром та 3'-кінцем РНК. Максимуми енергії (бар'єри) між мінімумами на рис. 5.10 відповідають проміжним станам при пересуванні полімерази (часткове порушення взаємодій, конформаційні зміни полімерази); ці максимуми є досить невисокими, тобто легко долаються за рахунок теплової енергії. Отже, полімераза спонтанно переміщується вперед, і система опиняється у більш глибокому мінімумі вільної енергії (рис. 5.10), звідки починається наступний елонгаційний цикл.

Якщо напрям переміщення полімерази визначається положенням мінімумів на шкалі вільної енергії, швидкість переміщення залежить від висоти максимумів вільної енергії: чим нижчим є максимум, тим легше він долається. Висота максимумів залежить від послідовності пар основ у складі гібрида, а також може змінюватись під дією додаткових факторів (фактори елонгації, шпильки в мРНК тощо).

Рис. 5.11. Таутомерні форми азотистих основ.

Під час елонгації здійснюється також редагування помилок. Забезпечити стовідсоткову точність операцій з такими невеликими молекулами, як нуклеотиди, практично неможливо. Зокрема, джерелом (одним з основних) помилкового приєднання нуклеотидів під час транскрипції є таутомерія азотистих основ. Спонтанні перебудови електронних систем гетероциклів призводять до того, що кожна основа існує у вигляді двох таутомерних форм: аміно- чи іміно-форми для A, C; енольної чи кето-форми для G, U, T (рис. 5.11). Рівновага зсунута в бік аміно- та кето-форм, які й присутні у складі подвійних спіралей (див. рис. 3.1) і для яких реалізуються правила комплементарності A-T, G-C. Але спарювання основ підпорядковуєтся іншим правилам для мінорних таутомерних форм: наприклад, іміно-форма А та аміно-форма С утворюють між собою 2 водневих зв'язки, що може відбутися під час впізнання матриці нуклеозидтрифосфатом. Тоді після хімічної реакції, в результаті швидкого повернення до мажорної таутомерної форми, у складі ДНК-РНК гібрида на 3'-кінці транскрипту залишиться некомплементарна пара нуклеотидів.

Нестабільність гібрида на 3'-кінці у випадку, коли щойно приєднаний нуклеотид є помилковим, призводить до зміни енергетичного балансу між різними позиціями РНК-полімерази відносно матриці (рис. 5.10). Найбільш сприятливою (такою, що відповідає найнижчому мінімуму енергії) тепер є позиція і, оскільки при цьому гібрид стає стабільним по усій довжині. Відповідно, відбувається зворотний рух полімерази з виходом 3'-кінця транскрипту у вторинний канал. При цьому ніщо більше не фіксує 3'-кінець транскрипту, і усі позиції позаду від і (і, і–1, і–2, ...) є майже ізоенергетичними (варіації залежать від стабільності гібриду, тобто від послідовності нуклеотидів). Отже, зворотний рух відбувається на невизначену випадкову відстань.

Коли 3'-кінцевий фрагмент транскрипту опиняється у вторинному каналі, з полімеразою у тому ж вторинному каналі взаємодіє особливий фактор елонгації транскрипції, який можна назвати фактором редагування і який існує у двох варіантах: GreA та GreB (еукаріотичним аналогом цих факторів є фактор TFIIS, див розділ 6). Gre-фактори, через конформаційні зміни РНК-полімерази, індукують нуклеазну активність її активного центра. В результаті відбувається відщеплення 3'-кінцевого фрагмента транскрипту і в активному центрі залишається новий 3'-кінець (зі стабільною нуклеотидною парою гібрида), який використовується для відновлення елонгаційного процесу.

З викладеного вище видно, що РНК-полімераза є одним з прикладів молекулярної машини (див. розділ 2). Конформаційна рухливість полімерази забезпечує їй можливість існувати у кількох структурних станах. Структурні стани мають різну спорідненість до певних лігандів (NTP, пари основ у складі РНК-ДНК гібрида, фактори елонгації). Взаємодії з лігандами фіксують певні стани. Хімічні реакції, які каталізуються машиною, призводять до заміни лігандів, а відповідно й до переходу в інший структурний стан. Рушійною силою для переміщення полімерази є тепловий рух: структурні блоки полімеразного комплексу рухаються у відповідності з конструкцією машини; зв'язування лігандів та їх заміна внаслідок реакцій каналізують ці рухи в певних напрямах. Результатом структурних перебудов є переміщення полімерази вздовж матриці з одночасним синтезом транскрипту із середньою швидкістю 40 нуклеотидів/с.