Ініціація транскрипції

Рис. 5.6. Типовий промотор E. coli. Зелена стрілка позначає старт транскрипції всередині розплавленої зони.

Зрозуміло, що РНК-полімераза може бути орієнтована відносно ДНК двома способами: кожній з цих орієнтацій буде відповідати два можливих напрямки руху ферменту при транскрипції. Відповідно, один з двох ланцюгів ДНК буде обиратися як матричний – той, з якого зчитується інформація у напрямку 3'–5' і на якому синтезується комплементарний ланцюг РНК у протилежному напрямку 5'–3' (рис. 5.6). Послідовність ланцюга ДНК, який є комплементарним матричному, таким чином, співпадає з послідовністю РНК, що синтезується. Тому саме цей нематричний ланцюг називають кодуючим або змістовним, і саме його послідовність прийнято наводити як послідовність даного гена (матричний ланцюг називають, відповідно, антикодуючим). Нуклеотид кодуючого ланцюга, який відповідає стартовому нуклеотиду РНК (частіше пуриновий), позначається як +1, наступні нуклеотиди (чи пари основ) у напрямку руху полімерази нумерують із позначкою “+“: +2, +3 і т.д. У зворотному напрямі (ліворуч на рис. 5.6) нуклеотиди нумерують із позначкою “–“ (починаючи з –1).

Типовий бактеріальний промотор (рис 5.6) складається з двох елементів послідовності, які знаходяться на відстані приблизно –10 та –35 від стартової точки. Консенсусна (узагальнена для різних промоторів) послідовність елемента –35 має вигляд T₈₂T₈₄G₇₈A₆₅C₅₄A₄₅ (числами позначено частоту даної пари основ у %). Послідовність елемента –10 (називається також боксом Прибноу (David Pribnow) – Pribnow box): T₈₀A₉₅T₄₅A₆₀A₅₀T₉₆. Варіабельність послідовностей визначає різну ефективність ініціації – силу промоторів. Саме елементи –35 та –10 безпосередньо впізнаються σ-фактором при ініціації транскрипції. Наведені послідовності впізнаються варіантом σ-фактора із молекулярною вагою 70 кДа (σ⁷⁰), який є досить широко вживаним, але не єдиним. Кільком іншим варіантам σ, під контролем яких знаходяться певні групи промоторів, відповідають інші консенсусні послідовності –35 та –10. Взаємодія σ-фактора з промотором чітко орієнтує РНК-полімеразу відносно ДНК, тобто визначає і стартову точку транскрипції, і її напрям (вибір одного з двох ланцюгів у якості матричного).

Вважається, що субодиниця σ утримує щелепи у відкритому положенні e складі голофермента. Це сприяє підвищенню швидкості дисоціації білка від непромоторної ДНК та гарантує низьку ефективність транскрипції з випадкових сайтів на ДНК (рис. 5.7). За умови впізнання σ-фактором двох елементів промотора відбувається структурна перебудова полімеразного комплексу із замиканням щелеп. У результаті ДНК у зоні пари основ +1 потрапляє всередину щілини між щелепами – утворюється закритий комплекс.

Рис. 5.7. Послідовність подій при ініціації транскрипції.

Дуже швидко закритий комплекс перетворюється на відкритий: замикання ДНК у щілині призводить до того, що подвійна спіраль не може там розміститися за недостатністю простору. В результаті відбувається локальне плавлення 12-14 пар основ (формування транскрипційного міхура) у зоні від –7 до +5 відносно стартової точки (рис. 5.6, 5.7). Важливим фактором, що сприяє локальному плавленню подвійної спіралі у складі відкритого комплексу, є наявність у циркулярній бактеріальній ДНК певного рівня негативної надспіралізації – напружень, що полегшують розкручування дуплекса (див. розділ 3). Плавлення ДНК у щілині РНК-полімерази відбувається за рахунок взаємодії двох ланцюгів із внутрішньою поверхнею щілини: нематричний ланцюг захоплюється певними структурними елементами полімерази, матричний – опиняється в активному центрі. За активним центром ДНК робить вигин приблизно під прямим кутом по відношенню до ДНК, що лежить нижче від активного центру.

Наступна, найбільш повільна стадія ініціації – синтез першого фосфодіефірного зв'язку, тобто ініціація власне синтезу РНК. Здатність ініціювати синтез нуклеїнової кислоти – унікальна властивість РНК-полімерази (ДНК-полімераза здатна лише продовжувати синтез вже існуючого ланцюга, див. розділ 9). Ініціація синтезу є дуже важкою, оскільки при цьому дві порівняно невеликі молекули – два перших нуклеотиди – мають бути жорстко зафіксовані в активному центрі у певній геометрії. Така фіксація залежить від взаємодій σ-фактора з активним центром: певною мірою субодиниця σ бере на себе роль 3'-кінцевої ділянки РНК, яка приймає участь у створенні сайта зв'язування чергового нуклеотида при елонгації (див. нижче), але якої ще не існує при ініціації.

Далі процес нарощування транскрипту продовжується ще до 8-9 нуклеотидів, які можуть розміститися в межах РНК-полімеразного комплексу до виходу в спеціальний канал. В процесі зростання цього первинного транскрипту можливе його визволення – абортивна ініціація. Взагалі, оточення активного центра РНК-полімерази має високу спорідненість до тимчасового РНК-ДНК гібриду, що існує під час транскрипції (див. рис. 5.4). Але чим коротшим є гібрид, тим менше взаємодій він реалізує з полімеразою і тим менш стабільним він є. Додаткова стабілізація короткого гібрида здійснюється завдяки взаємодії з ним σ-фактора.

Друга причина абортивної ініціації – конкуренція між σ-фактором та РНК за канал виходу. В принципі, після зростання транскрипту до 9-10 нуклеотидів σ-фактор більш не потрібен: “мавр зробив свою справу“. Можливий програш з боку РНК конкуренції за канал є своєрідною платою за можливість ініціювати синтез першого зв'язку. У випадку такого програшу голофермент може повторити свою спробу ініціювати транскрипцію. Якщо ж конкуренцію виграє РНК, σ-фактор (після синтезу ~12 нуклеотидів) нарешті витісняється з комплексу (відбувається очистка промотора), і розпочинається елонгація транскрипції.