13 Вопрос.
Мол-ген-ие методы предназначены для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК. В основе этих методов лежат манипуляции с ДНК и РНК. Они стали применяться с 70-80 гг.20 в. 1 ЭТАП. Получение образцов ДНК и РНК. Источником геномной ДНК м.б. любые ядросодержащие клетки. Чаще всего используют периферическую кровь (лейкоциты), амниотические клетки, культуры фибробластов Требуется небольшое кол-во ген.материала, если кровь-1мл,если клетки-1млгр. Иногда достаточно одной капли, неск. волосянных луковиц, соскоб эпителия со слизистой оболочки щеки. 2 ЭТАП. ПЦР-полимеразная цепная реакция-метод амплификации ДНК(invitro), за неск. часов можно размножить опред-ую послед-ть ДНК в млн раз и больше, поэтому необходимо небольшое кол-во материала, для проведения ПЦР надо знать нукл-ую послед-ть амплифицированного фрагмента. В соответствии с нукл-ой посл-ью синтез-ся 2 праймера (2 затравки). Процесс амплификации состоит из повторяющихся циклов, каждый цикл вкл. 3 стадии:1)темп-ая денатурация-разделение 2цепочной ДНК на 1цепочную. Присоединение праймеров к 1цепочной ДНК. Синтез полинукл-х цепей.2)рестрикция (разрезание) на фрагменты-осущ-ся при помощи фермента рестриктаз,имеется неск. десятков разл.видов таких ферментов,они способны разрезать ДНК на фрагменты из 4-6 нукл-х пар.Обнаружение опр-х фрагментов рестрицированной геномной ДНК на электрофеграмме возможно только путем их гибридизации с мечеными ДНК-зондами. ДНК-зонд – 1цепочная ДНК длиной до 30 нукл,используемая для поиска комплементарных посл-ей в мол.ДНК большого размера или среди множества разнообразных мол.ДНК.3)электрофарез фрагментов ДНК-движение фрагментов ДНКв гене, помещенном в постоянное Эл.поле от – к + полюсу. Чем больше масса фрагмента,тем медленнее он движется и наоборот. Секвенирование - определение последовательности нукл. на участке ДНК. Биотехнология-наука об исл.жив.орг-ов, бтопроцессов и систем в производстве, вкл.превращение некот.видов сырья в продукции.
Вопрос № 14
ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, международная программа, конечной целью которой является определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) всей геномной ДНК человека, а также идентификация генов и их локализация в геноме (картирование). Исходная идея проекта зародилась в 1984 среди группы физиков, работавших в Министерстве энергетики США и желавших заняться другой задачей после завершения работ в рамках ядерных проектов.
В 1988 Объединенный комитет, куда входили Министерство энергетики США и Национальные институты здоровья, представили обширный проект, в задачи которого – помимо секвенирования генома человека – входило всестороннее изучение генетики бактерий, дрожжей, нематоды, плодовой мушки и мыши (эти организмы широко использовались в качестве модельных систем в изучении генетики человека). Кроме того, предусматривался детальный анализ этических и социальных проблем, возникающих в связи с работой над проектом. Комитету удалось убедить Конгресс выделить на проект 3 млрд. долларов (один нуклеотид ДНК – за один доллар), в чем немалую роль сыграл ставший во главе проекта Нобелевский лауреат . Вскоре к проекту присоединились другие страны (Англия, Франция, Япония и др.). В России в 1988 с идеей секвенирования генома человека выступил академик А.А.Баев, и в 1989 в нашей стране был организован научный совет по программе «Геном человека».
В 1990 была создана Международная организация по изучению генома человека (HUGO), вице-президентом которой в течение нескольких лет был академик А.Д.Мирзабеков. С самого начала работ по геномному проекту ученые договорились об открытости и доступности всей получаемой информации для его участников независимо от их вклада и государственной принадлежности. Все 23 хромосомы человека были поделены между странами-участницами. Российские ученые должны были исследовать структуру 3-й и 19-й хромосом. Вскоре финансирование этих работ в нашей стране было урезано, и реального участия в секвенировании Россия не принимала. Программа геномных исследований в нашей стране была полностью перестроена и сконцентрирована на новой области – биоинформатике, которая пытается с помощью математических методов понять и осмыслить все, что уже расшифровано.
Закончить работу предполагалось через 15 лет, т.е. примерно к 2005. Однако скорость секвенирования с каждым годом возрастала, и если в первые годы она составляла несколько миллионов нуклеотидных пар за год по всему миру, то на исходе 1999 частная американская фирма «Celera», возглавляемая Дж.Вентером (J.Venter), расшифровывала не менее 10 млн. нуклеотидных пар в сутки. Этого удалось достичь благодаря тому, что секвенирование осуществляли 250 роботизированных установок; они работали круглосуточно, функционировали в автоматическом режиме и сразу же передавали всю информацию непосредственно в банки данных, где она систематизировалась, аннотировалась и становилась доступной ученым всего мира. Кроме того, фирма «Celera» широко использовала данные, полученные в рамках Проекта другими его участниками, а также разного рода предварительные данные. 6 апреля 2000 состоялось заседание Комитета по науке Конгресса США, на котором Вентер заявил, что его компания завершила расшифровку нуклеотидной последовательности всех существенных фрагментов генома человека и что предварительная работа по составлению нуклеотидной последовательности всех генов (предполагалось, что их 80 тыс. и что они содержат примерно 3 млрд. нуклеотидов) будет завершена через 3–6 недель, т.е. гораздо раньше, чем планировалось.
Доклад был сделан в присутствии представителя HUGO, крупнейшего специалиста по секвенированию д-ра Р.Уотерсона. Расшифрованный фирмой «Celera» геном принадлежал анонимному мужчине, т.е. содержал как X-, так и Y-хромосомы, а HUGO использовали в своих исследованиях материал, полученный от разных людей. Между Вентером и HUGO велись переговоры о совместной публикации результатов, однако они закончились безрезультатно из-за разногласий по поводу того, что считать завершением расшифровки генома. По мнению компании «Celera», об этом можно говорить лишь в том случае, если гены полностью секвенированы и известно, как расшифрованные сегменты располагаются в молекуле ДНК. Этому требованию удовлетворяли результаты «Celera», в то время как результаты HUGO не позволяли однозначно определить взаимное положение расшифрованных участков. В результате в феврале 2001 в специальных выпусках двух авторитетнейших научных журналов, «Science» и «Nature», были раздельно опубликованы результаты исследований «Celera» и HUGO и приведены полные нуклеотидные последовательности генома человека, охватывающие около 90% его длины.
Пуповинная кровь, в состав которой входят стволовые клетки, макрофаги, лимфоциты, ретикулоциты - собирается во время родов. Клетки пуповинной крови используют для молекулярно-генетической диагностики, которая позволяет выявить поврежденные гены и оценить риски развития наследственных болезней, выявить носительство заболевания и назначить своевременную терапию и диету. Остальные методы только уточняют и дополняют результаты генетической диагностики. Из части этих клеток выделяется ДНК. В диагностике по программе «Гемаскрин» используются два основных метода: полимеразная цепная реакция (ПЦР) и автоматическое секвенирование. В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определенного участка ДНК при помощи ферментов, в результате чего получают достаточное для исследования количество ДНК человека. Это дает возможность существенно повысить точность ДНК-диагностики. Секвенирование представляет собой определение нуклеотидной последовательности определенного гена и ее автоматический анализ.Программа ДНК диагностики разработана в партнерстве с лучшими специалистами России по медицинской генетике. Все работы проводятся в лицензированной лаборатории, соответствующей стандартам.Методы диагностики "Гемаскрин" отличаются высокой точностью и быстротой проведения анализа, в отличие от биохимического скрининга, который лишь с той или иной долей вероятности предсказывает патологию и требует дополнительной диагностики.
Под генетическими маркерами понимают любые наследуемые фенотипические признаки, различающиеся у отдельных особей.
Фенотипические признаки, отвечающие требованиям генетических маркеров, весьма разнообразны. Они включают в себя как особенности поведения или предрасположенность к определенным заболеваниям, так и морфологические признаки целых организмов или их макромолекул, различающихся по структуре. Молекулярные маркеры используются при построении генетических карт сцепления.
Банк генов – геномная библиотека, или клонотека – набор клонированных фрагментов ДНК, представляющих индивидуальный или групповой (видовой) геном.В случае крупных геномов (человек, млекопитающие и др.) получают банк генов для каждой индивидуальной хромосомы. В некоторых случаях термин «банк генов» используют для обозначения коллекций генов (или генотипов) с которыми ведется селекционная работа.