Практическое занятие № 4.

Тема: Иммунный ответ. Антигенное распознавание. Антигенпредставляющие клетки. Межклеточные взаимодействия. Клеточный и гуморальный ответ.

Учебная цель:

1. Изучить механизмы иммунного ответа

2. Изучить механизмы регуляции иммунного ответа

Студент должен знать:

1. Механизмы иммунного ответа

2. Механизмы регуляции иммунного ответа

3. Функции главного комплекса гистосовместимости

Студент должен уметь:

1. Интерпретировать результаты оценки иммунного статуса

План занятия

1.Первичный и вторичный иммунный ответ.

2. Механизмы иммунного ответа.

3. Регуляция иммунного ответа.

4. Главный комплекс гистосовместимости.

5. Клеточный и гуморальный ответ.

Самостоятельная работа студентов:

1. Интерпретировать результаты оценки иммунного статуса по готовым иммунограммам

2. Интерпретировать результаты серологических реакций по готовым иммунограммам

ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ

-

Текущая версия страницы пока не проверялась опытными участниками и может значительно отличаться от версии, проверенной 11 апреля 2012; проверки требует 1 правка.

Имму́нная систе́ма — подсистема, существующая у позвоночных животных и объединяющая органы и ткани, которые защищают организм от заболеваний, идентифицируя и уничтожая опухолевые клетки и патогены. Иммунная система распознает множество разнообразных возбудителей: от вирусов до паразитических червей - и отличает их от биомолекул собственных клеток. Распознавание возбудителей усложняется их адаптацией и эволюционным развитием новых методов успешного инфицирования организма-хозяина.

Конечной целью иммунной системы является уничтожение чужеродного агента, которым может оказаться болезнетворный микроорганизм, инородное тело, ядовитое вещество или переродившаяся клетка самого организма. Этим достигается биологическая индивидуальность организма.

В иммунной системе развитых организмов существует множество способов обнаружения и удаления чужеродных агентов, этот процесс называется иммунным ответом. Все формы иммунного ответа можно разделить на приобретённые и врождённые реакции. Основное различие между ними в том, что приобретённый иммунитет высокоспецифичен по отношению к конкретному типу антигенов и позволяет быстрее и эффективнее уничтожать их при повторном столкновении. Антигенами называют вызывающие специфические реакции организма молекулы, воспринимаемые как чужеродные агенты. Например, у перенёсших ветрянку, корь, дифтерию людей часто возникает пожизненный иммунитет к этим заболеваниям. В случае аутоиммунных реакций антигеном может служить молекула, произведенная самим организмом.

Эволюция иммунных механизмов

Защитные механизмы, направленные на распознавание и обезвреживание возбудителей, существуют даже у прокариот: например, ряд бактерий обладает ферментными системами, которые предотвращают заражение бактерии вирусом. Другие базовые иммунные механизмы развились в процессе эволюции у древних эукариот и сохранились у их современных потомков, в том числе у растений и животных. К таким механизмам относятся антимикробные пептиды, которые называются дефенсинами, рецепторы распознавания специфических последовательностей и система комплемента.

Короткие фрагменты РНК, которые избирательно синтезируются только в клетках половых органов (открыты в 2000-х годах), способны подавлять активность транспозонов (могут вызывать мутации при перемещении по геному) и передаются по материнской линии потомству. Потомство дрозофил получает в комплекте с ДНК такой молекулярный переключатель, который подавляет активность вредных генетических элементов^[1].

Более сложные механизмы развились относительно недавно, в ходе эволюции позвоночных^[2].

Иммунная система у позвоночных (например, у человека) состоит из множества видов белков, клеток, органов и тканей, взаимодействия между которыми сложны и динамичны. Благодаря такой усовершенствованной иммунной реакции система позвоночных со временем приспосабливается, и распознавание конкретных чужеродных веществ или клеток становится более эффективным. В процессе адаптации создается иммунологическая память, которая позволяет ещё более эффективно защищать организм при следующей встрече с этими возбудителями. Такой вид приобретённого иммунитета лежит в основе методик вакцинации.

У теплокровных сохранение гомеостаза уже обеспечивается двумя иммунными механизмами (разными по времени эволюционного появления): температура (общее воздействие) и антитела (избирательное воздействие).

Морфология иммунной системы

Иммунная система человека и других позвоночных представляет из себя комплекс органов и клеток, способных выполнять иммунологические функции. Прежде всего иммунный ответ осуществляют лейкоциты. Бо́льшая часть клеток иммунной системы происходит из кроветворных тканей. У взрослых людей развитие этих клеток начинается в костном мозге. Лишь T-лимфоциты дифференцируются внутри тимуса (вилочковой железы). Зрелые клетки расселяются в лимфоидных органах и на границах с окружающей средой, около кожи или на слизистых оболочках.

Организм животных, обладающих механизмами приобретённого иммунитета, производит множество разновидностей специфических иммунных клеток, каждая из которых отвечает за какой-то определённый антиген. Наличие большого количества разновидностей иммунных клеток необходимо для того, чтобы отражать атаки микроорганизмов, способных мутировать и изменять свой антигенный состав. Значительная часть этих клеток завершает свой жизненный цикл, так и не приняв участие в защите организма, например, не встретив подходящих антигенов.

Многоэтапность иммунной защиты

Иммунная система защищает организм от инфекции в несколько этапов, при этом с каждым этапом повышается специфичность защиты. Самая простая линия защиты представляет собой физические барьеры, которые предотвращают попадание инфекции — бактерий и вирусов — в организм. Если возбудитель проникает через эти барьеры, промежуточную неспецифическую реакцию на него осуществляет врождённая иммунная система. Врождённая иммунная система обнаруживается у всех растений и животных^[3]. На случай, когда возбудители успешно преодолевают воздействие врожденных иммунных механизмов, у позвоночных существует третий уровень защиты — приобретённая иммунная защита. Эта часть иммунной системы адаптирует свою реакцию во время инфекционного процесса, чтобы улучшить распознавание чужеродного биологического материала. Такой улучшенный ответ сохраняется после уничтожения возбудителя в виде иммунологической памяти. Она позволяет механизмам приобретённого иммунитета развивать более быструю и более сильную ответную реакцию при каждом появлении такого же возбудителя^[4].

Две стороны иммунной системы
Врождённый иммунитет	Приобретённый иммунитет
Реакция неспецифична	Специфическая реакция, привязанная к чужеродному антигену
Столкновение с инфекцией приводит к немедленной максимальной реакции	Между контактом с инфекцией и максимальным ответом латентный период
Клеточные и гуморальные звенья	Клеточные и гуморальные звенья
Не обладает иммунологической памятью	Столкновение с чужеродным агентом приводит к иммунологической памяти
Обнаруживается практически у всех форм жизни	Обнаружена только у некоторых организмов

Как врождённый, так и приобретённый иммунитет, зависят от способности иммунной системы отличать свои молекулы от чужих. В иммунологии под своими молекулами понимают те компоненты организма, которые иммунная система способна отличить от чужеродных^[5]. Напротив, чужими называют молекулы, которые распознаются как чужеродные. Один из классов "чужих" молекул называют антигенами (термин произошёл от сокращения англ.  antibody generators — «вызывающие антитела») и определяют как вещества, связываемые со специфическими иммунными рецепторами и вызывающие иммунный ответ^[6].

Клеточные факторы врождённого иммунитета

Лейкоциты (белые кровяные тельца) часто ведут себя подобно независимым одноклеточным организмам, и представляют собой главное клеточное звено врождённого (гранулоциты и макрофаги) и приобретённого (в первую очередь лимфоциты, но их действия тесно связаны с клетками врождённой системы) иммунитета. К клеткам, воплощающим неспецифическую («врождённую») иммунную реакцию, относятся фагоциты (макрофаги, нейтрофилы и дендритные клетки), тучные клетки, базофилы, эозинофилы и естественные киллеры. Эти клетки распознают и уничтожают чужеродные частицы путём фагоцитоза (заглатывания и последующего внутриклеточного переваривания) либо, в случае крупных чужеродных тел (например, паразитов или крупных опухолевых клеток), путём выделения разрушительных частиц при непосредственном контакте^[26]. Кроме того, осуществляющие неспецифический иммунитет клетки являются важными посредниками в процессе активации механизмов приобретённого иммунитета^[4].

Приобретённый иммунитет

Система приобретённого иммунитета появилась в ходе эволюции низших позвоночных. Она обеспечивает более интенсивный иммунный ответ, а также иммунологическую память, благодаря которой каждый чужеродный микроорганизм «запоминается» по уникальным для него антигенам^[40]. Система приобретённого иммунитета антигенспецифична и требует распознавания специфических чужих («не своих») антигенов в процессе, называемом презентацией антигена. Специфичность антигена позволяет осуществлять реакции, которые предназначены конкретным микроорганизмам или инфицированным ими клеткам. Способность к осуществлению таких узконаправленных реакций поддерживается в организме «клетками памяти». Если макроорганизм инфицируется микроорганизмом более одного раза, эти специфические клетки памяти используются для быстрого уничтожения такого микроорганизма.

Лимфоциты

Лимфоциты

Клетки иммунной системы, на которые возложены ключевые функции по осуществлению приобретённого иммунитета, относятся к лимфоцитам, которые являются подтипом лейкоцитов. Большая часть лимфоцитов отвечает за специфический приобретённый иммунитет, так как могут распознавать возбудителей инфекции внутри или вне клеток, в тканях или в крови.

Основными типами лимфоцитов являются B-клетки и T-клетки, которые происходят из плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток; у взрослого человека они образуются в костном мозге^[26], а T-лимфоциты дополнительно проходят часть этапов дифференцировки в тимусе. B-клетки отвечают за гуморальное звено приобретённого иммунитета, то есть вырабатывают антитела, в то время как T-клетки представляют собой основу клеточного звена специфического иммунного ответа.

На этапе развития лимфоциты проходят отбор: остаются только значимые с точки зрения защиты организма, а также те, которые не несут угрозы собственным тканям организма.^{[источник не указан 1130 дней]} Параллельно с этим процессом лимфоциты разделяются на группы, способные выполнять ту или иную функцию защиты. Существуют разные виды лимфоцитов. В частности, по морфологическим признакам их разделяют на малые лимфоциты и большие гранулярные лимфоциты (БГЛ). По структуре внешних рецепторов среди лимфоцитов выделяют, в частности, B-лимфоциты и T-лимфоциты.

Как B-, так и T-клетки несут на своей поверхности рецепторные молекулы, которые распознают специфические мишени. Рецепторы представляют из себя как бы «зеркальный отпечаток» определённой части чужеродной молекулы, способный присоединяться к ней. При этом одна клетка может содержать рецепторы только для одного вида антигенов.

T-клетки распознают чужеродные («не-свои») мишени, такие как патогенные микроорганизмы, только после того, как антигены (специфические молекулы чужеродного тела) будут обработаны и презентированы в сочетании с собственной («своей») биомолекулой, которая называется молекулой главного комплекса гистосовместимости (англ. main histocompatibility complex, MHC). Среди T-клеток различают ряд подтипов, в частности, Т-киллеры, Т-хелперы и регуляторные Т-клетки.

T-киллеры распознают только антигены, которые объединены с молекулами главного комплекса гистосовместимости I класса, в то время как T-хелперы распознают только антигены, расположенные на поверхности клеток в сочетании с молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса. Это различие в презентации антигена отражает разные роли указанных двух типов T-клеток. Другим, менее распространённым подтипом T-клеток, являются γδ T-клетки, которые распознают неизмененные антигены, не связанные с рецепторами главного комплекса гистосовместимости^[41].

У T-лимфоцитов круг задач весьма широк. Часть из них — регуляция приобретённого иммунитета с помощью специальных белков (в частности, цитокинов), активация B-лимфоцитов для образования антител, а также регуляция активации фагоцитов для более эффективного разрушения микроорганизмов. Эту задачу выполняет группа T-хелперов. За разрушение собственных клеток организма путём выделения цитотоксичных факторов при непосредственном контакте отвечают T-киллеры, которые действуют специфически.

В отличие от T-клеток, B-клетки не нуждаются в обработке антигена и экспрессии его на поверхности клетки. Их рецепторы к антигену представляют собой фиксированные на поверхности B-клетки антителоподобные белки. Каждая прошедшая дифференцировку линия B-клеток экспрессирует уникальное только для неё антитело, и никакое другое. Таким образом, полный набор антигенных рецепторов всех B-клеток организма представляет все антитела, которые организм может вырабатывать^[26]. Функция B-лимфоцитов заключается прежде всего в выработке антител — гуморального субстрата специфического иммунитета —, действие которых направлено прежде всего против внеклеточно расположенных возбудителей.

Кроме того, существуют лимфоциты, неспецифически проявляющие цитотоксичность — естественные киллеры.

T-киллеры

T-киллеры напрямую атакуют другие клетки, несущие на своей поверхности чужеродные или аномальные антигены^[42].

Т-киллеры представляют собой подгруппу T-клеток, функцией которых является разрушение собственных клеток организма, инфицированных вирусами или другими патогенными внутриклеточными микроорганизмами^[43], либо клеток, которые повреждены или неверно функционируют (например, опухолевые клетки). Как и B-клетки, каждая конкретная линия T-клеток распознает только один антиген. T-киллеры активируются при соединении своим T-клеточным рецептором (ТКР) со специфическим антигеном в комплексе с рецептором главного комплекса гистосовместимости I класса другой клетки. Распознавание этого комплекса рецептора гистосовместимости с антигеном осуществляется при участии расположенного на поверхности T-клетки вспомогательного рецептора CD8. В лабораторных условиях T-клетки обычно выявляют именно по экспрессии CD8. После активации T-клетка перемещается по организму в поисках клеток, на которых белок I класса главного комплекса гистосовместимости содержит последовательность нужного антигена. При контакте активированного T-киллера с такими клетками он выделяет токсины, образующие отверстия в цитоплазматической мембране клеток-мишеней, в результате ионы, вода и токсин свободно перемещаются в клетку-мишень и из неё: клетка-мишень погибает^[44]. Разрушение собственных клеток T-киллерами важно, в частности, для предотвращения размножения вирусов. Активация T-киллеров жестко управляется и обычно требует очень сильного сигнала активации от комплекса белка гистосовместимости с антигеном, либо дополнительной активации факторами T-хелперов

Т-хелперы регулируют реакции как врожденного, так и приобретенного иммунитета, и позволяют определять тип ответа, который организм окажет на конкретный чужеродный материал^[45][46]. Эти клетки не проявляют цитотоксичности и не участвуют в уничтожении инфицированных клеток или непосредственно возбудителей. Вместо этого, они управляют иммунным ответом, направляя другие клетки на выполнение этих задач.

T-хелперы экспрессируют T-клеточные рецепторы (ТКР), которые распознают антигены, связанные с молекулами II класса главного комплекса гистосовместимости. Комплекс молекулы главного комплекса гистосовместимости с антигеном также распознается корецептором клеток-хелперов CD4, который привлекает внутриклеточные молекулы T-клетки (например, Lck), ответственные за активацию T-клетки. T-хелперы обладают меньшим чувствительностью к комплексу молекулы главного комплекса гистосовместимости и антигена, чем T-киллеры, то есть для активации T-хелпера требуется связывание гораздо большего количества его рецепторов (около 200—300) с комплексом молекулы гистосовместимости и антигена, в то время как T-киллеры могут быть активированы после связывания с одним таким комплексом. Активация T-хелпера также требует более продолжительного контакта с антиген-презентирующей клеткой^[47]. Активация неактивного T-хелпера приводит к высвобождению им цитокинов, которые оказывают влияние на активность многих видов клеток. Цитокиновые сигналы, создаваемые T-хелперами, усиливают бактерицидную функцию макрофагов и активность T-киллеров^[7]. Кроме того, активация T-хелперов вызывает изменения в экспрессии молекул на поверхности T-клетки, в частности лиганда CD40 (также известного под обозначением CD154), что создает дополнительные стимулирующие сигналы, обычно требуемые для активации вырабатывающих антитела B-клеток^[48].

Гамма-дельта T-клетки

5-10 % T-клеток несут на своей поверхности ТКРгамма-дельта и обозначаются как γδ T-клетки.

B-лимфоциты и антитела

В-клетки составляют 5-15 % циркулирующих лимфоцитов и характеризуются поверхностными иммуноглобулинами, встроенными в клеточную мембрану и выполняющими функцию специфического антигенного рецептора. Этот рецептор, специфичный лишь для определенного антигена, называется антителом. Антиген, связываясь с соответствующим антителом на поверхности В-клетки, индуцирует пролиферацию и дифференцировку В-клетки до плазматических клеток и клеток памяти, специфичность которых такая же, как и специфичность исходной В-клетки. Плазматические клетки секретируют большое количество антител в виде растворимых молекул, распознающих исходный антиген. Секретируемые антитела имеют ту же специфичность, что и соответствующий В-клеточный рецептор.

Иммунологическая память

Иммунологическая память — это способность иммунной системы отвечать более быстро и эффективно на антиген (патоген), с которым у организма был предварительный контакт.

Такая память обеспечивается предсуществующими антигенспецифическими клонами как В-клеток, так и Т-клеток, которые функционально более активны в результате прошедшей первичной адаптации к определённому антигену.

Пока неясно, устанавливается ли память в результате формирования долгоживущих специализированных клеток памяти или же память отражает собой процесс рестимуляции лимфоцитов постоянно присутствующим антигеном, попавшим в организм при первичной иммунизации.

Главный комплекс гистосовместимости — это группа генов и кодируемых ими антигенов клеточной поверхности, которые играют важнейшую роль в распознавании чужеродного и развитии иммунного ответа. Главный комплекс гистосовместимости человека получил название HLA. Антигены HLA подразделяются на антигены классов I и II. Антигены HLA класса I необходимы для распознавания трансформированных клеток цитотоксическими T-лимфоцитами. Важнейшая функция антигенов HLA класса II — обеспечение взаимодействия между T-лимфоцитами и макрофагами в процессе иммунного ответа. T-хелперы распознают чужеродный антиген лишь после его переработки макрофагами, соединения с антигенами HLA класса II и появления этого комплекса на поверхности макрофага. Способность T-лимфоцитов распознавать чужеродные антигены только в комплексе с антигенами HLA называют ограничением по HLA. Определение антигенов HLA классов I и II имеет большое значение в клинической иммунологии и используется, например, при подборе пар донор—реципиент перед трансплантацией органов

Клеточная кооперация в иммунном ответе

Главный комплекс гистосовместимости (ГКГС; синоним МНС - major histocompatibility complex; HLA - human leucocyte antigens). На коротком плече С6 хромосомы человека расположено несколько генетических локусов, которые контролируют синтез некоторых белков, играющих важную роль в иммунном ответе и, прежде, всего, в клеточных взаимодействиях. Совокупность этих локусов (генов) получила название главного комплекса гистосовместимости (ГКГС). Локусы подразделены на 3 класса:

Класс I содержит три наиболее изученных локуса А, В, С, каждый из которых может быть представлен вариантами одного и того же гена (аллелями).

А локус включает 41 вариант, В - 71, С - 27. Вероятно, вариантов много больше.

Функция продуктов E, F, G, H локусов также относящихся к классу I, остаются неясными. Локусы (гены) класса I контролируют синтез гликопротеидов, выполняющих роль клеточных рецепторов. Структура рецепторов класса I представлена на рисунке 34. Тяжелая цепь димера гликопротеида (45 к D а) состоит из гидрофильного цитоплазматического домена (участка), гидрофобного трансмембранного, константного внеклеточного ( a - 3) и двух внеклеточных вариантных ( a - 2, a - 1). Домен a - 1 имеет короткую углеводную цепочку (УЦ). Легкая цепь димера представлена b ₂ - микроглобулином (12 кDа), который входит в состав ее константной части. Она не имеет вариантов, кодируется одним из генов 15 хромосомы, не относящимся к ГКГС. Щель между a ₁ - a ₂ и b ₂ М является активным центром связывания и презентации антигена ( антигенных детерминант) Т - цитотоксическим лимфоцитам (Тс). Рецепторы класса I имеются на поверхности любых ядросодержащих клеток организма, что лежит в основе его индивидуальной антигенной специфичности. Они обеспечивают «узнавание» собственных клеток макроорганизма, межклеточную кооперацию, презентацию антигена.

Класс II локусов включает несколько генов. Три из них ( DP , DQ , DR ) изучены лучше, роль других (и контролируемых ими продуктов) неясна. Локусы (гены) DP, DQ, DR контролируют синтез a и b цепей клеточных рецепторов и могут иметь аллели (альтернативные варианты генов). Рецептор ГКГС класса II представляет собой гликопротеид, состоящий из двух цепей. Цепь А представлена вариабельным внеклеточным доменом a - 1(34 к D а), константным внеклеточным доменом a - 2 (34 к D а), гидрофобным трансмембранным и гидрофильным цитоплазматическими доменами. Домены a - 1и a - 2 имеют по одной короткой углеводной цепочке. Цепь В также имеет 4 домена: вариабельный внеклеточный b - 1 (28 к D а) с одной углеводной цепочкой, константный внеклеточный b - 2 (28 к D а), гидрофобный трансмембранный и гидрофильный цитоплазматический. Щель между a - 1 и b - 1 представляет собой активный центр рецептора. Рецепторы ГКГС класса II имеются только на макрофагах, В-лимфоцитах и некоторых активированных Т-лимфоцитах.

Класс III локусов ГКГС содержит гены, контролирующие синтез некоторых компонентов, участвующих в активации С3 компонента комплемента. Контролируемые этими генами компоненты системы комплемента (С4 , фактор В, С2) секретируются в кровь, циркулируют вместе с ней, но на мембранах клеток организма они не фиксируются. 

Процессинг и презентация антигена

Всякая микробная клетка представляет собой сложный антигенный комплекс, в состав которого входят десятки антигенов, каждый из которых индуцирует «свой» иммунный ответ. Таким образом, иммунный ответ на микроб является суммарным эффектом ответа на большинство антигенов, входящих в его структурные и функциональные компоненты. Расщепление микробной клетки до отдельных антигенов осуществляется вспомогательными клетками, прежде всего макрофагами, и носит название процессинга . Роль рецепторов ГКГС состоит в транспортировке пептидов (антигенов) на клеточную поверхность и представлении их (презентации) другим клеткам, участвующим в клеточной кооперации при иммунном ответе.

При поражении соматических клеток макроорганизма микробами, для которых характерно внутриклеточное паразитирование (вирусы, риккетсии, хламидии , микоплазмы , микобактерии и др.) процессинг антигена осуществляется в протеосомах , а затем пептиды (антигены) транспортируются рецепторами ГКГС- I на поверхность этих клеток. Комплекс ГКГС- I - пептид является сигналом для СD 8 - цитолитической клетки, инициирующей процесс лизиса пораженной клетки вместе с патогеном.

Другая ситуация возникает при заболеваниях, для возбудителей которых внутриклеточное паразитирование не является обязательным (сальмонеллез, шигеллез и др.). Процессинг антигена выполняется после фагоцитоза возбудителя или эндоцитоза его компонентов макрофагами на территории их эндосом . Пептиды (антигены) транспортируются молекулами ГКГС- II на поверхность макрофага и презентируются другим иммунокомпетентным клеткам для последующей продукции антител.

Т-клеточный рецептор cостоит из двух цепей: a -цепь представлена 4 доменами: вариабельный внеклеточный домен, константный внеклеточный домен, гидрофобный внутримембранный и гидрофильный цитоплазматический (Мм - 50 кDa), b - цепь имеет аналогичные домены (Мм - 45 кDa).

Корецепторы межклеточных взаимодействий

На поверхности клеток, принимающих участие в иммунном ответе, расположены белковые молекулы (молекулярные комплексы) выполняющие роль корецепторов межклеточных взаимодействий. Известно более 200 корецепторов и они обозначаются номерами соответственно принятой классификации таких комплексов ( cluster of designation ) - CD 1 _ CD 100 и т.д. CD рецепторы могут быть представлены на Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах, моноцитах, макрофагах, гранулоцитах и др. Функция некоторых корецепторов сводится к распознаванию «своей» антигенпредставляющей клетки. Например, Т-лимфоцит, имеющий CD 4 (Т-хелпер), или CD 8 (цитолитический Т-лимфоцит), распознают «свою» антигенпредставляющую клетку через «узнавание» рецепторов ГКГС - II или ГКГС - I. Дополнительно Т-цитолитический лимфоцит (Тс) проводит это «узнавание» и через CD 28 корецептор Т с и CD 80/86 макрофага. Другие CD рецепторы (CD 25 , 121,122,124,126,127,128,130 и др.) обладают свойствами некоторых интерлейкинов . Взаимодействие отдельных рецепторов (CD 154 Th 2 и CD 40 В-лимфоцитов) приводит к образованию комплекса, обладающего свойством мощного индуктора пролиферации В-лимфоцитов. Роль многих корецепторов изучена еще недостаточно.

Клеточный тип иммунного ответа

Пусковым звеном в формировании клеточного типа иммунного ответа является продукция макрофагом, на территории которого идет процессинг антигена, интерлейкина ИЛ-12. События развиваются следующим образом.

ГКГС - I макрофага презентирует пептид (антиген) Т-хелперу (CD 4 ). Под влиянием ИЛ-12, продуцируемого этим же макрофагом, Th трансформируется в Th 1. g - IFN является важнейшим из цитокинов , выделяемых Th 1. Он активирует контакт Т CD 8 с рецептором ГКГС - I макрофага, на котором представлен тот же антиген. Выделяемый Th 1 ИЛ-2 стимулирует пролиферацию таких, уже антигенспецифических Т-цитолитических лимфоцитов (Тс). Главной функцией Т с в противоинфекционной защите является уничтожение соматических клеток организма, внутри которых находится возбудитель, а на поверхности - метка, комплекс ГКГС-I - антиген патогена . При прямом контакте с такой клеткой Т с выделят гранулы, содержащие белки - перфорин , гранзим . Перфорин встраивается в мембрану соматической клетки, образует в ней каналы «поры» и может действовать как мембраноатакующий белок. Гранзим ( сериновые протеиназы ) индуцирует один из вариантов апоптоза и гибель соматической клетки вместе с находящимися в ней микробами.

Гуморальный (антительный) тип иммунного ответа

При развитии гуморального ответа В-лимфоцит может получить микробный пептид разными путями:

• Получение растворимого антигена из окружающей микросферы. Пептид не требует дополнительной обработки, так как это уже сделано другой клеткой. Происходит селекция антигеном В-лимфоцита (В-лимфоцитов), имеющего предсуществующие g - глобулиновые рецепторы на своей поверхности, наиболее специфические к данному антигену.

• Получение растворимого антигена с помощью g - глобулинового рецептора, его дальнейший процессинг на территории В-лимфоцита и представления на мембране В-лимфоцита в комплексе с ГКГС- II В-лимфоцита.

• Получение антигена с поверхности макрофага. Селекция В-лимфоцитов по g - рецепторам. Процессинг антигена в В-лимфоцитах и его представление Т-лимфоцитам.

ГКГС- II макрофага презентирует антиген Т-хелперу (CD 4 ). Под влиянием Ил-4, продуцируемого нейтрофилами, тучными клетками, базофилами, эозинофилами Т h трансформируется в Т h 2 индуцирующих гуморальный тип иммунного ответа. Важнейшими из интерлейкинов , продуцируемых этими лимфоцитами, являются ИЛ-4,5,6,10, резко стимулирующие пролиферацию избранных в результате селекции В-лимфоцитов. Синтезируемые трансформированными В-лимфоцитами ( плазмоцитами ) антитела специфичны к данному антигену. Гуморальный тип ответа наиболее важен в отношении внеклеточно расположенных микробов. Антитела усиливают их поглощение и переваривание фагоцитами.

Особенности иммунитета при бактериальных, грибковых и протозойных инфекциях

Антибактериальный иммунитет

Формирование механизмов саногенеза (выздоровления) при различных бактериальных инфекциях лежит в основе некоторых особенностей иммунитета, возникающего в течение таких заболеваний. Так, при бактериальных инфекциях, возбудители которых продуцируют экзотоксин (дифтерия, столбняк ботулизм, газовая гангрена и др.) ведущую роль в формировании иммунитета играют образующиеся в организме антитела (антитоксины). Взаимодействие молекулы антитоксина и молекулы токсина может приводить к разным результатам:

• Блокаде рецепторного участка молекулы токсина и, вследствие этого, ограничению фиксации токсина на рецепторах клеток-мишеней;

• Прямой нейтрализации каталитического (энзиматического, токсического) участка молекулы токсина;

• к бразованию иммунного комплекса с нейтрализацией токсического, рецепторного и (или) транслокационного участков (субъединиц) токсина. Такие комплексы фагоцитируются и утилизируются клетками макроорганизма. Однако антитоксические антитела не блокируют адгезию бактерий на поверхности клеток-мишеней и их колонизацию. Вследствие этого, искусственный антитоксический иммунитет не создает полной защиты макроорганизма и не предотвращает фиксацию бактерий на поверхности клеток-мишеней, колонизацию клеток и ткани, размножение бактерий.

При другой группе бактериальных инфекций (менингококковая инфекция, коклюш, легионеллез и др.) решающая роль принадлежит иммунному лизису и фагоцитозу бактерий. Образующиеся при этих заболеваниях IgG инициируют целый ряд антителоопосредованных биологических реакций:

а) при фиксации АТ на поверхности бактерий происходит активация комплемента по классическому варианту с образованием мембраноатакующего комплекса и последующим лизисом обнаженных участков мембран бактерий;

б) опсонизация бактерий антителами с последующим взаимодействием F с - фрагментов антител с F с - рецепторами макрофагов, что приводит к усилению поглотительной и периваривающей активности фагоцита;

в) образующийся комплекс «бактериальный АГ - АТ - С 1,4,2,3В » фиксируются на рецепторах макрофагов к С3В, что также ведет к усилению поглотительной активности таких комплексов фагоцитами;

г )нейтрализация антителами антифагинов , выделяемых бактериями наружу (фактор, препятствующий образованию фагоцитами псевдоподий; фактор, препятствующий миграции макрофагов) или входящих в состав их анатомических структур (М-протеин стрептококков, капсульные вещества пневмококков и др.).

Таким образом, формирующийся при этих заболеваниях иммунитет зависит от уровня циркулирующих IgG , содержания и активности компонентов комплемента, а также от функционального состояния фагоцитов.

К следующей группе бактериальных инфекций, со своими особенностями формирования иммунитета, относятся такие, возбудители которых являются внутриклеточными паразитами, способными длительно существовать внутри фагоцитов и даже размножаться в них (туберкулез, туляремия, бруцеллез, листериоз и др.).

Основными механизмами, позволяющими бактериям осуществлять внутриклеточный паразитизм являются :

• Блокада фаголизосомального слияния (микобактерии туберкулеза);

• Резистентность бактерий к действию лизосомальных ферментов (гонококки, стафилококки);

• Способность бактерий быстро покидать фагосомы после поглощения и длительно пребывать в цитоплазме (листерии).

Для заболеваний с длительным внутриклеточным пребыванием и размножением возбудителя (персистенция) характерно образование гранулем в пораженной ткани. Такие бактерии становятся недоступными для действия антител и гуморальных антибактериальных факторов. Механизм саногенеза и формирования иммунитета при таких заболеваниях связан, прежде всего, с образованием цитотоксических Т-лимфоцитов, оказывающих киллинг-эффект на клетки-мишени, содержание в них паразитирующих бактерий и маркированных рецепторами ГКГС- I, презентирующих АГ этих бактерий. 

Особенности иммунитета при грибковых заболеваниях

Особенности противогрибкового иммунитета зависят от морфологических свой ств гр ибков (размеры клеток, форма), сложности их антигенного состава, изменчивости в зависимости от условий существования, формы и стадии микоза.

Большинство грибков относятся к свободноживущим организмам и только некоторые из них способны вызывать заболевания. Более того, для возникновения заболевания у человека необходимым условием является наличие у него иммунодефицита по полиморфноядерным лейкоцитам, Т-лимфоцитам, С 3 компоненту комплемента. Функциональными дефектами лейкоцитов является их неспособность образовывать псевдоподии (синдром «ленивых лейкоцитов»), неспособность формировать фаголизосомы (синдром Чедиака-Хигаси), нарушение способности к продукции активных форм кислорода, обеспечивающих переваривание микроба. Дефицит по С3 также ведет к снижению активности фагоцитов. И, наконец, наиболее часто микозы у человека возникают при низкой продукции Т-лимфоцитов (Тс, Т h). Формирование иммунитета связывают с восстановлением функциональной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов и усиленной продукцией Т-лимфоцитов.

Специфические антитела образуются лишь при некоторых формах глубоких микозов. Считают, что они не принимают участия в механизмах защиты, являясь свидетелями иммунной перестройки организма.

Особенности иммунитета при протозойных заболеваниях

Особенности обусловлены внутриклеточной локализацией возбудителей, изменчивостью их поверхностных антигенов, наличием антигенов, общих с антигенами клеток человека, иммуносупрессивными свойствами паразитов.

При протозойных заболеваниях могут образовываться Ig М и IgG , но специфичность их крайне низка вследствие их образования в результате поликлональной активации В-лимфоцитов и антигенной изменчивости паразитов. Выздоровление наступает при активации Т-лимфоцитов (Тс, Тh). Полноценный постинфекционный иммунитет формируется очень редко.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 5.

Тема: Антитела. Виды, строение, свойства. Образование иммунных комплексов.

Учебная цель:

1. Изучить физиологические механизмы иммунитета.

2. Изучить серологические методы лабораторной диагностики.

3. Изучить комплементзависимые серологические реакции,

4. Изучить реакции иммунитета с меченными компонентами.

План занятия

1. Антитела, классификация. Структура иммуноглобулинов, основные классы.

2. Виды антител.

3. Строение антител.

4. Свойства антител.

5. Образование иммунных комплексов.

Самостоятельная работа студентов:

1. Постановка и учет ориентировочной реакции агглютинации на предметном стекле с целью идентификации выделенной чистой культуры грамотрицательных палочек.

2. Постановка и учет развернутой реакции агглютинации с целью серодиагностики брюшного тифа.

3. Постановка и учет реакции термокольцепреципитации с целью сероиндикации сибирской язвы.

4. Постановка и учет реакции связывания комплемента с целью серодиагностики сифилиса

ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ.

Антитела

Антитела представляют собой белки глобулиновой природы (иммуноглобулины) образующиеся в организме под воздействием антигена и обладающие способностью избирательно связываться с ним. Существуют пять разновидностей молекул (классов) иммуноглобулинов с молекулярной массой от 150 до 900 тыс. дальтон: IgM, lgG, IgA, IgE, IgD. Молекулы иммуноглобулинов состоят из двух легких (L) и двух тяжелых (Н) полипептидных цепей, соединенных между собой дисульфидными связями . Оба типа цепей, соединенных между собой, обладают антигенностью. У тяжелых цепей она специфична для каждого класса иммуноглобулинов и соответственно классам Н-цепи обозначаются m , g , a , e , s . Легкие цепи в антигенном отношении делятся на две разновидности - X и l , одинаковые для, разных классов. Антигенные различия тяжелых цепей используют для получения антисывороток, позволяющих выявить наличие в исследуемом материале иммуноглобулинов того или иного класса. Легкие цепи IgG состоят из двух участков (доменов): вариабельных (VL) и константных (CL). Тяжелые цепи включают в себя один вариабельный ( V Н) и 3 константных участка (CH ₁ , CH ₂ , СН ₃ ). Вариабельные участки легких и тяжелых цепей формируют активные центры антител (VL -VH). Участок CL - CH 1 определяет небольшие различия в последовательности расположения аминокислот у индивидуумов одного и того же вида (аллоантигенные различия молекул IgM). Область CH ₂ -CH ₂ участвует в фиксации и активации комплемента, а область СН ₃ -СН ₃ - в фиксации антитела к клеткам (лимфоцитам, макрофагам, тучным клеткам). Данный тип строения молекулы характерен и для всех остальных классов иммуноглобулинов, различия заключаются в дополнительной организации этой основной единицы. Так, Н-цепь IgM состоит не из 4, а из 5 доменов, а вся молекула IgM представляет собой пентамер молекулы IgG, соединенный дополнительными полипептидными J-цепями. IgA может быть в форме мономеров, димеров и секреторного IgA. Последние две формы имеют дополнительные (димеры) J или J и S цепи (секреторный). Другие свойства антител представлены в таблице 5.

Основные характеристики иммуноглобулинов человека

© п/п	Показатели	IgM	IgG	IgA	IgE	IgD
1.	Молекулярная масса	900т.	150т.	170т. и 300т.	190т.	180т.
2.	Уровень в крови в г/л	0,5 - 1,8	6 -16	1 - 5	0,00002	0,03 - 0,04
3.	Тип тяжелых цепей	m 1 - m 2	g 1 - g 4	a 1 - a 2	e	s
4.	Формула	5 H5L	2H2L	4H4L	2H2L	2H2L
5.	Фиксация С	++++	++	+ S	-	-
6.	Нейтрализация токсинов	+	+	+	-	-
7.	Агглютинация	+	+	+	-	-
8.	Бактериолиз	+	+	?	-	-
9.	Прохождение плаценты	-	+	-	-	-

Молекула антитела связывается с детерминантой антигена не целиком, а лишь определенной своей частью, называемой активным центром. Активный центр представляет собой полость или щель, соответствующую пространственной конфигурации детерминантной группы антигена. Один из активных центров по разным причинам может быть функционально инертным. Такие антитела называются неполными. Их появлению обычно предшествует образование полных, т. е. антител с двумя (IgG) активными центрами. Неполные антитела встречаются у разных классов иммуноглобулинов.

Основная масса антител образуется в клетках плазмоцитарного ряда (плазмобласт, проплазмоцит, плазмоцит). Каждая из них продуцирует антитела только одной специфичности, т. е. к одной антигенной детерминанте.

Территориально эти клетки располагаются в селезенке, лимфоузлах, костном мозге, лимфоидных образованиях слизистых оболочек. При первичном контакте организма с антигеном и антителообразовании различают индуктивную и продуктивные фазы. Продолжительность первой фазы составляет около 2 суток. В этот период происходит пролиферация и дифференцировка лимфоидных клеток, развитие плазмобластической реакции. Вслед за индуктивной наступает продуктивная фаза. В сыворотке крови антитела начинают определяться с З-го дня после контакта с антигеном. Эти антитела относятся к классу IgM. С 5-7 дня происходит постепенная смена синтеза IgM на синтез IgG той же специфичности. Обычно к 12-15 дню кривая антителообразования достигает максимума, далее уровень антител начинает снижаться, но определенное их количество можно обнаружить и через много месяцев, а иногда и лет. При повторном контакте организма с тем же антигеном индуктивная фаза занимает лишь несколько часов. Продуктивная фаза протекает быстрее и интенсивнее, осуществляется синтез преимущественно IgG.

Для выделения и очистки молекул иммуноглобулинов применяют хроматографический и электрофоретический методы с предшествующим первичным фракционированием исходной многокомпонентной смеси (сыворотки крови человека, иммунизированного животного) путем избирательного осаждения молекул одного или нескольких видов. Фракционирование осаждением основано на различной растворимости биополимеров (глобулинов) в водных растворах, которая определяется наличием и соотношением гидрофобных и гидрофильных группировок в их структуре. Белки, несущие на поверхности значительное количество гидрофобных аминокислотных остатков, например глобулины, плохо растворимы в водной среде с низкой ионной силой, а белки, характеризующиеся низкой гидрофобностью (альбумины), обладают высокой растворимостью в воде. С увеличением ионной силы раствора, в котором находятся глобулины, их растворимость повышается, однако по достижении определенного предела концентрации они начинают агрегировать и выпадать в осадок. Происходит солевое осаждение молекул - высаливание. Так как глобулины разных классов отличаются друг от друга по характеру растворимости при высоких концентрациях соли, то постепенно увеличивая ионную силу раствора, в котором находятся различные молекулы, можно последовательно перевести их в нерастворимое состояние - высолить. Эффективными солями для осаждения иммуноглобулинов являются сульфаты и фосфаты, цитраты натрия, калия и аммония. Из органических растворителей для фракционирования иммуноглобулинов больших размеров чаще всего используют этанол и риванол. В последние годы для осаждения сывороточных белков используют водорастворимые полимеры - полиэтиленгликоль и сульфат декстрана. Так, для осаждения IgM применяют 6% концентрацию полиэтиленгликоля, для осаждения IgG - 12% и для осаждения IgA - 14% концентрацию.

Отдельные глобулины, перешедшие под воздействием различных реагентов в нерастворимое состояние, представляют собой достаточно крупные агрегаты, которые можно отделить от раствора фильтрованием. В современных биологических исследованиях широко используют фильтры из стекловолокна, асбеста, нитроцеллюлозы, ацетатцеллюлозы, целлюлозы, тефлона, нейлона, капрона, поливинилхлорида и др. Полученные фракции иммуноглобулинов обычно подвергают более тонкой очистке хроматографией или электрофорезом. К настоящему времени разработаны различные виды. хроматографии, среди которых наиболее распространены гель-фильтрация, ионообменная и аффинная. Существует множество приемов применения каждого из видов хроматографии - колоночная, в тонких слоях и т. д. Гранулами набухшего в каком-либо растворителе геля с пористой структурой наполняют колонки, наслаивают сверху на столб геля осажденную фракцию иммуноглобулинов с разными молекулярными массами и пропускают их через гель.

Поскольку гранулы геля имеют пористую структуру, то часть молекул, размеры которых меньше величины пор, проникают в гранулы и мигрируют определенное время в их сетчатой структуре. Молекулы, размеры которых больше величины пор, не проникают в гранулы, а, огибая их, продвигаются быстрее. В результате молекулы глобулинов элюируются из хроматографической колонки поочередно - в порядке уменьшения их молекулярных масс. Субфракции глобулинов с разной молекулярной массой собирают раздельно. Для гельфильтрации применяют три вида гранулированных гелей: декстрановые (сефадекс типов от G-10-грубый до G-200-сверхтонкий), агарозы (сефарозы) полиакриламидные (биогели, акрилексы). В основе метода ионообменной хроматографии лежит применение носителей, состоящих из нерастворимой основы (гели декстрана, агарозы, полиакриламида) с фиксированными на ней функциональными группами (сульфометильными, сульфоэтильными, сульфопропильными, карбоксиметильными или карбоксиэтильными и др. катионов). При пропускании через ионообменник с положительно заряженными, функциональными группами (катионообменник) смеси глобулинов, имеющих отрицательный, заряд, последние свяжутся с ними. Связавшиеся глобулины отличаются между собой изоэлектрическими точками, и их можно затем в определенной последовательности элюировать из ионообменника. Принцип иммуноаффинной хроматографии заключается в том, что на носителе (агароза, целлюлоза, гели сефадекса или полиакриламида, бентонит и др.) сорбируют функционально активные молекулы антигенов. При пропускании через такой иммуносорбент фракций иммуноглобулинов произойдет образование комплекса носитель-антиген-иммуноглобулин. В последующем комплекс диссоциируют для получения чистой фракции иммуноглобулина. Иммуносорбент используют многократно. Разделение классов глобулинов проводят также с использованием метода электрофореза, так как их электрофоретическая подвижность различна.

Генетический контроль биосинтеза антител

Типичная молекула иммуноглобулина состоит из 2Н и 2 L цепей (обе X- 70% или обе l - l 30%). Полипептидные цепи синтезируются на рибосомах В-лимфоцитов, собираются в молекулу (глобулу) и транспортируются либо на клеточную поверхность, где они выполняют роль В-клеточных рецепторов, либо в кровь, где они выполняют функции антител. Синтез полипептидных цепей контролируется тремя генными локусами, расположенными на разных хромосомах. Локусы имеют различные комбинации, в зависимости от контроля той или иной цепи и могут содержать следующие участки:

• L - кодирует лидерный пептид, необходимый для секреции антител на поверхность клетки;

• V - гены вариабельной части антитела;

• C - гены константной части;

• J - гены соединительной области полипептида;

• D - гены дополнительной вариабельности.

Таким образом, в каждой В-клетке, синтезирующей только один класс (подкласс) антител, функционирует один из локусов генетического контроля синтеза легких цепей (один из многочисленных вариантов V и I или I - C ) и локус контроля синтеза Н-цепи (один из вариантов V , D , I , C ). Многообразие вариантов генов в одной В-клетке обеспечивает общее количество потенциальных вариантов образования антител всеми В-клетками организма до 10 ⁷ , а при учете сплайсинга (неточности считывания информации с ДНК этих локусов В-лимфоцита) вариабельность образования специфических антител возрастает до 10 ⁸ .