Занятие 2 Цитогенетический метод генетики человека.

Цель: Изучить строение хромосом как материальных основ наследования. Ознакомить и обучить основным методам цитогенетики человека.

Задачи занятия:

1. Разобрать теоретический материал.

2. Изучить строение, классификацию хромосом человека.

3. По таблицам, слайдам и атласу научиться определять хромосомные заболевания - фенотипы и кариотипы.

4. Освоить технику приготовления микропрепаратов кариотипа человека и полового хроматина.

5. Освоить современные методы цитогенетики человека.

6. Решить ситуационные задачи.

Формируемые компетенции:

ОК-1, ПК-9, ПК-31, ПК-32

Студент должен знать:

1. Содержание следующих понятий: нуклеосома; кариотип; кариограмма; половой хроматин; наследственная болезнь; синдром; идиограмма.

2. Химический состав и строение хромосом под световым и электронным микроскопами.

3. Биологическую роль хромосом.

4. Методику приготовления и диагностическое значение кариограмм человека.

5. Классификацию хромосом.

6. Характеристику кариотипа здоровых мужчин и женщин.

7. Фенотипические проявления и кариотипы при следующих синдромах: Патау, Эдвардса, Клайнфельтера, Дауна, Шерешевского-Тернера, трисомии по Х-хромосоме, лишней У-хромосоме.

8. Методику и диагностическое значение определения Х-и У-хроматина в медицинской практике.

9. Новейшие методы, используемые для цитогенетического анализа.

Студент должен уметь:

1. Составлять кариограмму человека

2. По описанию фенотипа больного определять хромосомное заболевание.

3. Анализировать кариограмму человека и определять пол и хромосомное заболевание человека.

Студент должен владеть:

1) основными понятиями цитогенетики;

2) навыками устного и письменного описания изучаемого материала.

Оснащение занятия:

1. Таблицы

А) Кариотипы здоровых мужчин и женщин, синдромы Дауна, Патау, Эдвардса, Шерешевского-Тернера, Клайнфельтера, трисомии по Х-хромосоме, лишней У хромосоме

Б) Атлас – Фотографии препаратов по мультицветной FISH

В) Набор фотографий хромосом и кариотипов здоровых и больных людей.

2. Технические средства

1. ноутбук

2. проектор

3. микроскоп световой

3. Микропрепараты:

1. Политенные хромосомы;

2. Кариотип человека.

Хронологическая карта занятия:

1. Организационная часть;

2. Тестовый контроль базового уровня знаний;

3. Объяснение практического задания;

4. Самостоятельная работа;

5. Проверка выполненных работ в тетрадях;

6. Установка задания для подготовки к следующей теме.

Теоретический обзор

Изучите материал, используя следующую литературу:

1. «Биология», учебник в 2 т/ под ред. В.Н. Ярыгина. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011.

2. «Биология», учебник в 2 т/ под ред. В.Н. Ярыгина, М.: Медицина, 2006 г

3. Биология/ А.А. Слюсарев, С.В. Жукова, - К: Высшая школа, 1987.

4. Электронная версия учебно-методического пособия (каф. мед. биологии и генетики).

Практические навыки:

Цитогеиетическне методы включают в себя следующее:

1. Определение кариотипа.

2. Определение X и У-полового хроматина.

Метод определения кариотипа человека заключается в изучении количества и строения метафазных митотических или профазных и метафазных мейотичеоких хромосом.

Изучение кариотипа производятся обычно по медицинским показаниям. Например, тогда, когда рождается ребенок с множественными уродствами, что заставлявляет подозревать у него наличие хромосомных аберраций. Кариотипнрование совершенно необходимо, когда подозреваются изменения хромосом типа транслокации.

Изучение кариотипа человека проводится чаще всего на метафазных пластинках лейкоцитов периферической крови, У исследуемого больного из локтевой вены берут 2-3 мл крови в стерильную пробирку, Для получения высокой митотнческой активности к исследуемой крови добавляют ФГА - фитогемоагглютинин (вытяжка из бобов фасоли). Пробирку помещают в термостат на 46 часов. Затем добавляют в нее вещество колхицин для разрушения нитей ахроматинового веретена, чтобы приостановить расхождение хроматид во время митоза. Из содержимого пробирки готовят препараты, которые после окраски красителем Гимзы микроскопируют с иммерсионным 90-кратным объективом. Затем получают микрофотографии готового препарата. Группируя попарно гомологичные хромосомы, вырезанные с данной фотографии, строят идиограмму, т.е. располагают хромосомы в порядке уменьшения их длины. Затем хромосомы идентифицируют согласно унифицированной денверской системы классификации:

Таблица 1. Распределение хромосом согласно Денверской номенклатуры.

Группа	Величина хромосомы	Положение центромеры	№ идио-граммы	Число хромосом в 2n наборе
				жен	муж
1. (А)	Самые крупные	Медианное и частично субмедианное	1-3	6	6
2. (В)	Крупные	Субмедианное	4-5	4	4
3. (С)	Средние	Субмедианное	6-12, Х	16	15
4. (D)	Средние	Субтерминальное	13-15	6	6
5. (E)	Относительно мелкие	Медианное и субмедианное	16-18	6	6
6. (F)	Маленькие	Медианное	19-20	4	4
7. (G)	Наиболее маленькие	Субтерминальное	21-22,У	4	5

После составления иднограммы определяют пол организма, наличие хромосомного заболевания и хромосомных аберраций.

Гораздо шире применяется в практике метод экспресс-диагностики, или метод определения полового хроматина.

Наиболее часто половой хроматин определяют в клетках слизистой оболочки рта или в мазках крови. Х-половой хроматин выявляется в ядре клеток эпителия рта в виде компактной глыбки хроматина, называехой тельцем Бappa. В лейкоцитах периферической крови он выявляется в виде «барабанных палочек» - глыбок хроматина, связанных тонкой нитью с ядром клетки.

У-хромосому выявляют с помощью люминесцентной микроскопии в соматических клетках мужчин

Цитогенетические методы широко используют в медицинской и судебно-медицинской практике» Так, с помощью цитогенетических методов осуществляют:

I/ изучение кариотипов

2/ уточнение числа хромосомных наборов, количества, морфологии отдельных хромосом для диагностики хромосомных болезней

3/ составление генетических карт хромосом V изучение геномных и хромосомных мутаций

5/ определение пола организма.

б) Обозначение числовых нарушений хромосом.

При описании кариотипа сначала указывается общее число хромосом, включая половые, а затем через запятую без пробела - набор половых хромосом. Таким образом, нормальный кариотип человека обозначается следующим образом: 46,XX - нормальный женский и 46,XY - нормальный мужской кариотип.

Изменение в системе половых хромосом отмечается путем непосредственного их перечисления после указания общего числа хромосом в наборе. Лишняя или недостающая аутосома при конституциональных или приобретенных хромосомных нарушениях обозначается знаком "+" или "-", который ставится перед номером хромосомы через запятую после перечисления половых хромосом:

45,Х - кариотип с одной X хромосомой (синдром. Шерешевского-Тернера);

47,XXY - кариотип с двумя X хромосомами и одной Y хромосомой (синдром Клайнфельтера);

47,XYY - кариотип с одной X и двумя Y хромосомами;

47,ХХХ - кариотип с тремя X хромосомами;

47,ХХ,+21 - кариотип с трисомией по 21-й хромосоме (синдром Дауна);

47,ХХ,+13 - кариотип с трисомией по 13-й хромосоме (синдром Патау);

47,ХХ,+18 - кариотип с трисомией по 18-й хромосоме (синдром Эдвардса-Смита);

46,ХХ,+8,-21 - кариотип с трисомией 8 и моносомией 21.

Для отличия между мозаицизмом (наличия в одном организме нескольких клеточных линий, возникших из одной зиготы) и химернзмом (наличия в одном организме нескольких клеточных линий, возникших из разных зигот) используются сокращения mos и chi - mos 45,X/46,XX и chi 46,XX/46,XY соответственно.

В случае мозаицизма нормальный диплоидный клон клеток, если он присутствует, всегда указывается последним - mos 47,XXY/46,XX.

Если имеется несколько аномальных клеточных клонов, то сначала указывается наибольший, а остальные перечисляются по мере убывания. При этом независимо от доли нормального клеточного клона он всегда указывается последним. В квадратных скобках указывается число обнаруженных клеток с данным кариотипом - mos 45,Х[15]/47,ХХХ[10]/46,ХХ[23].

Наибольший из имеющихся клеточных клонов у химер указывается первым: chi 46,XX[25]/46,XY[10].

в) Обозначение структурных перестроек хромосом.

При наличии структурных хромосомных нарушений для описания кариотипа применяется как короткая форма записи аномального кариотипа, указывающая только на характер хромосомного нарушения, так и развернутая форма, обозначающая конкретные поврежденные сегменты хромосом и степень протяжения вовлеченных в перестройку фрагментов хромосом. Одно двоеточие (:) указывает на разрыв хромосомы, а двойное двоеточие (::) указывает на разрыв и воссоединение. Для избегания громоздкой записи хромосомного дисбаланса между точками разрывов хромосомы часто указывают стрелку (—>), означающую протяженность фрагмента хромосомы от одного участка до другого.

При наличии повреждения структуры одной хромосомы, после символа обозначающего характер этого повреждения, в круглых скобках указывается номер этой хромосомы. Если известны точки повреждения хромосомы, то они перечисляются в других круглых скобках с указанием плеча, региона и сегмента аберрантной хромосомы. Символ del используется для обозначения как терминальных, так и интерстициальных делеций. Стрелка (—>) не используется в короткой системе записи.

46,XX,dup(5)(pl5) - дупликация сегмента р15 в 5 хромосоме;

46,XX,del(5)(ql3) - терминальная делеция длинного плеча 5 хромосомы в сегменте ql3 (короткая форма записи) или 46,XX,del(5)(pter—>ql3:) - терминальная делеция длинного плеча 5 хромосомы в сегменте ql3. Оставшаяся в результате делеций хромосома 5 состоит из целого короткого плеча - от его терминального участка и части длинного плеча – до сегмента 5ql3 с разрывом в этом сегменте (развернутая форма записи);

При перестройке двух хромосом с двумя разрывами, сначала в круглых скобках указываются номера этих хромосом, между которыми ставится знак ";", а затем в других круглых скобках соответственно указываются поврежденные плечи этих хромосом и точки разрывов. Первой указывается хромосома с более низким номером. Однако, если в перестройке участвует половая хромосома, то она указывается первой:

46,XУ,t(12;16)(q13;p11) - транслокация между хромосомами 12 и 16 с двумя точками разрывов, один из которых затрагивает сегмент 13 длинного плеча хромосомы 12, а второй - сегмент 11 короткого плеча хромосомы 16.

Упомянутое выше правило первого указания хромосомы с более низким номером или половой хромосомы не применяется в случае перестройки хромосом с тремя разрывами, когда часть одной хромосомы вставлена в другую. Если какой-либо участок хромосомы встраивается в другой сегмент той же самой хромосомы, то точка встраивания всегда указывается первой. В случае прямой ннсерции оставшиеся точки поломки указываются следующим путем: сначала более проксимальная точка, а затем более дистальная. В случае инвертированной ннсерции применяется обратная запись - сначала указывается дистальная точка разрыва, а затем проксимальная:

46,XX,ins(2)(ql3pl3p23) - прямая вставка фрагмента короткого плеча хромосомы 2 (участка р!3-р23) в сегмент q13 этой же хромосомы.

Дериваты хромосом или структурно перестроенные хромосомы, обозначаемые символом der, образуются в результате: 1) двух и более перестроек в пределах одной хромосомы, например инверсии и делеции той же самой хромосомы или делеции обоих плеч одной хромосомы; 2) перестройки, вовлекающей две и более хромосомы, например насбалансированный продукт транслокации. Термин "дериват" всегда применяется к хромосоме, имеющей интактную центромеру. Перестроенная хромосома указывается в скобках за которыми перечисляются все аберрации, вовлеченные в образование этого хромосомного деривата:

46,XX,der(9)del(9)(pl2)del(9)(q31) или 46,XX,der(9)(:pl2->q31:) - дериват хромосомы 9, возникший в результате терминальных делеции в коротком и длинных плечах с точками поломок в сегментах 9р12 и 9q31;

Робертсоновские транслокации, возникающие путем центрического слияния длинных плеч акроцентрических хромосом 13-15 и 21-22 с потерей их коротких плеч могут быть адекватно описаны с использованием символа der или rob:

45,XX,der(13;21)(13qter-+13ql0::21ql0—>21qter) - развернутая форма записи робертсоновской транслокации между 13 и 21 хромосомами; 46,XX,der(21;21)(q10;q10),+21 - транслокационный вариант синдрома Дауна;

Транслокации целых плеч хромосом описываются обозначением точек разрывов в центромерных районах р10 и q10. При сбалансированных обменах целыми плечами двух разных хромосом точка разрыва в хромосоме более низкого номера или в половой хромосоме указывается как р10:

46,XY,t(l;3)(p10;q10) - краткая форма записи реципрокной транслокации целых плеч хромосом 1 и 3. Короткое плечо хромосомы 1 слилось в центромерной области с длинным плечом хромосомы 3, а длинное плечо хромосомы 1 - с коротким плечом хромосомы 3.

Термин "филадельфийская хромосома" сохранился по историческим причинам для описания деривата хромосомы 22, образованного в результате транслокации t(9;22)(q34;q11) при хроническом миелолейкозе. Аббревиатура Ph может быть использована в тексте, но не для описания кариотипа, который указывается как 46,XУ,der(22)t(9;22)(q34;q11).

Символ diс используется для описания дицентрических хромосом, а idic - для изодицентрических хромосом. Дицентрическая хромосома рассматривается как одна хромосома:

45,XY,dic(13;15)(q22;q24) - дицентрическая хромосома, образованная хромосомами 13 и 15, замещающая эти две нормальные хромосомы (краткая форма записи);

Символ i применяется для обозначения изохромосом, образующихся в результате разрыва в центромерном районе хромосом в сегментах р10 и q10 в соответствии с морфологией изохромосомы:

46,X,i(X)(qlO) или 46,X,i(X)(qter—>qlO::qlO—>qter) - кариотип с одной нормальной X хромосомой и изохромосомой X по длинному плечу;

Аномальная хромосома, в которой ни одна из ее частей не может быть однозначно идентифицирована с помощью традиционных методов дифференциального окрашивания хромосом обозначается как маркерная (mаг) хромосома:

47,ХХ,+таг - кариотип с одной маркерной хромосомой.

Фрагильные или ломкие сайты хромосом, обозначаемые символом fra, могут встречаться как нормальные варианты хромосом или могут быть связаны с аномалиями фенотипа. Они проявляют себя как участки хромосом, обнаруживающие разрывы или пробелы хроматид, в ответ на определенные условия культивирования клеток или действие специфических реагентов. Выделяют 2 типа фрагильных сайтов - наследуемые (около 30) и обычные или конститутивные (около 80). Из всех фрагильных сайтов хромосом важное клиническое значение имеет ломкий сайт Xq27.3, экспрессирующийся у некоторых индивидов в условиях культивирования клеток с низким содержанием в питательной среде фолиевой кислоты. У лиц с этим наследуемым фрагильным сайтом (обозначаемым FRAXA) выявляется один из наиболее частых синдромов умственной отсталости - синдром фрагильной или ломкой Х-хромосомы или синдром Мартина-Белл:

46,X,fra(X)(q27.3) - ломкая хромосома X в локусе q27.3 у женщины;

46,Y,fra(X)(q27.3) - ломкая хромосома X в локусе q27.3 у мужчины.

Флюоресцентная гибридизация in situ (англ. - Fluorescence In Situ Hybridization - FISH) Представляет собой реакцию гибридизации специфических ДНК-зондов на те или иные известные участки генома с ДНК хромосом исследуемого индивида. В основе этой реакции лежит феномен комплиментарного спаривания азотистых оснований ДНК. В качестве ДНК-зондов выступают любые клонированные последовательности ДНК, выделенные фрагменты ДНК, целые хромосомы и их участки, отдельные гены и т.д. Для обнаружения (детекции) ДНК-зонда перед проведением гибридизации в его состав вводят специфические «метки» (молекулы), которые маркируют данный зонд и позволяют увидеть его непосредственно на исследуемых хромосомах (in situ).

Исторически первым методом гибридизации in situ был радиоактивный вариант детекции (1969), впоследствии модифицированный в неизотопный - флюоресцентный (1986). При флюоресцентной гибридизации in situ ДНК-зонды «метят» двумя способами: 1) ДНК-зонд метится непосредственно флюоресцирующими репортерными молекулами, конъюгированными с нуклеотидами (прямая детекция); 2) Сначала ДНК-зонды метятся репортерными молекулами (биотин, дигоксигенин), которые затем «узнаются» с помощью других соединений (например, авидином) или антител, коньюгированных с флюорохромами (например, родамином) (непрямая детекция). ДНК-зондов проводится чаще всего в ходе реакции ник-трансляции, заключающейся во внесении одноцепочных разрывов («ников») в молекулу ДНК с последующим восстановлением ее структуры за счет имеющихся в реакционной смеси свободных нуклеотидов, в том числе и коньюгированных с репортерными молекулами. В настоящее время разработаны и другие способы мечения ДНК-зондов.

FISH-анализ проводят на цитологических препаратах с метафазными хромосомами или интерфазными ядрами любых клеток организма. Для этого пригодны любые клетки организма, но наиболее часто используются лимфоциты периферической крови, клетки буккального эпителия, фибробласты кожи, клетки ворсин хориона и амниотической жидкости.

Основные этапы FISH-анализа включают:

1. Прегибридизация. Обработка цитологических препаратов РНК-азой и пепсином;

2. Денатурация анализируемой двухцепочечной ДНК на одноцепочечньге молекулы в 70% формамиде;

4. Гибридизация с ДНК-зондом; Отмывка неспецифически связанного ДНК-зонда с препаратов в 50% формамиде;

5. Детекция: прямая или непрямая. Для непрямой детекции проводят последовательную обработку препарата соединениями или антителами, коньюгированными с соответствующими флюорохромами.

Метод позволяет проанализировать числовые аномалии хромосом в метафазных и интерфазных клетках (особенно для выявления небольших по численности клеточных клонов; исследование процессов мутагенеза), их структурные нарушения, уточнить происхождение сложных комплексных структурных перестроек хромосом и картировать гены.

Типы ДНК-зондов и область их применения:

1. Центромероспецифичные ДНК-зонды. Это клонированные в составе какого-либо вектора (например, бактериальной плазмиды) фрагменты ДНК, содержащие высокоповторяющиеся последовательности нуклеотидов в центромерном или прицентромерном гетерохроматине, но обладающие полной или относительной специфичностью к центромерным районам определенных хромосом. При полной специфичности таких ДНК-зондов они связываются с центромерным районом только одной хромосомы, а относительно специфические ДНК-зонды связываются с центромерными районами двух или более хромосом. Применяются для анализа числовых нарушений хромосом в метафазных и интерфазных клетках, исследования происхождения маркерных хромосом, анализа хромосомного мозаицизма, определения пола плода.

2. Теломерные ДНК-зонды. Это клонированные фрагменты ДНК, содержащие последовательности нуклеотидов, специфичные к теломерным районам определенных хромосом. Применяются для анализа структурных нарушений хромосом (особенно скрытых микроделеций) в терминальных районах короткого или длинного плеча конкретной хромосомы.

3. Хромосомоспецифичные ДНК-библиотеки. Это совокупность уникальных последовательностей ДНК, покрывающих всю длину определенной хромосомы. Такие ДНК-зонды, полностью окрашивающие индивидуальную хромосому после проведения процедуры гибридизации и детекции, получили название "painting''-пробы. Применяются для идентификации целых хромосом или их фрагментов в исследуемых метафазных пластинках, при исследовании происхождения сложных транслокаций, дупликаций, инсерций и маркерных хромосом.

4. Уникальные ДНК-зонды. Это клонированные уникальные последовательности ДНК, строго специфичные для определенных районов хромосом или отдельных генов. Применяются для исследования синдромов, связанных с микроструктурными перестройками хромосом и для целей картирования генов.

Модификации FISH-метода:

1. Супрессионная гибридизация in situ (англ. - Chromosomal In Situ Supression - CISS). Принцип CISS-анализа заключается в использовании для гибридизации меченых репортерной молекулой (например биотином) набор хромосомоспецифических ДНК-проб, маркирующих всю длину анализируемой хромосомы, вместе с избытком немеченой высокоповторяющейся конкурирующей ДНК. Диспергированные повторяющиеся последовательности, локализованные в ДНК-пробах, быстро гибридизуются с конкурирующей ДНК (супрессируются), в то время как уникальные последовательности остаются однонитчатыми и поэтому не теряют способности гибридизоваться в дальнейшем с соответствующей хромосомой. Эти меченные уникальные последовательности ДНК детектируются на хромосомах с помощью коньюгированных с флюорохромом молекул. Область применения соответствует области использования "painting''-проб.

2. Синтез ДНК in situ с помощью олигонуклеотидных праймеров (англ. - Oligonucleotide Primed In Situ DNA Synthesis - PRINS). Метод заключается в амплификации ДНК in vitro непосредственно на цитологических препаратах с использованием олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих исследуемый фрагмент ДНК. Эта технология позволяет проводить быструю идентификацию хромосом на цитологических препаратах за счет амплификации высококопийных хромосомоспецифичных семейств повторяющихся последовательностей ДНК с использованием флюоресцентно меченых нуклеотидов. Современные модификации PRINS-анализа дают возможность идентифицировать и уникальные гены.

3. Мультицветная FISH. Это технология окрашивания в одной метафазе разных участков хромосом или нескольких пар гомологичных хромосом разными цветами. Заключается в одновременном использовании в рамках одной реакции гибридизации in situ нескольких ДНК-зондов, меченных разными репортерными молекулами или нуклеотидами, конъюгированными с разными флюорохромами. В последние годы новые технологии позволяют окрашивать каждую из 23 пар хромосом в индивидуальный цвет. Наиболее часто для мечения используют всего 5 флюорохромов (Су5, DEAC, FITC. Spectrum Orange, Texas Red) или их комбинации друг с другом. При проведении детекции ее осуществляют с помощью флюоресцентного микроскопа и компьютерных программ, которые производят наложение полученных изображений для каждого отдельного флюорохрома в единое изображение.

Технология спектрального кариотипирования (SKY - Spectral Kariotyping) имеет много общего с мультицветным FISH анализом. Мечение полной геномной библиотеки также осуществляется с использованием комбинаций пяти флюорохромов. Однако детекция гибридизационных сигналов проводится с помощью интерферометра, который позволяет анализировать соотношение интенсивности свечения всех пяти флюорохромов сразу., в то время как при мультицветной FISH проводится последовательный анализ каждого флюорохрома.

C.O.B.R.A. (Combined Binary RAtio labelling). Принцип метода заключается в использовании специальных комплексов из трех флюорохромов для мечения хромосомной библиотеки. Допустим, что имеется комплекс из трех флюорохромов - А, В и С. Для мечения каждой индивидуальной хромосомы выбирается одна из комбинаций двух любых флюорохромов, отличающихся по соотношению их концентраций. Так, например, хромосома 1 может быть маркирована смесью 25%А+75%В, хромосома 2 - 50%А и 50%С и т.д. Соотношение концентраций двух флюорохромов, используемых для ник-трансляции, выбирается как 0%:100%; 25%:75%; 50%:50%; 75%:25%; 100%:0%. Каждое из этих пяти сочетаний обусловливает возможность получения пяти различных цветов, следовательно, один комплекс из трех флюорохромов обеспечивает индивидуальную окраску 12 хромосом, а для идентификации всех хромосом набора требуется два набора флюорохромов.

Применение мультицветной FISH:

A.Клиническое применение:

• медицинская генетика (детекция числовых и структурных хромосомных аномалий, идентификация маркерных хромосом);

• онкология (идентификация происхождения неопластических клеток, анализ клеток костного мозга после его пересадки, мониторинг эффектов лечения, обнаружение раннего рецидива рака, установление хромосомных перестроек в области локализации протоонкогенов и антионкогенов в неделящихся или интерфазных клетках, детекция амплификации генов при некоторых неопластических процессах).

B. Использование в научных исследованиях:

• молекулярно-цитогенетический анализ хромосомных аномалий в опухолевых тканях и их эволюция при прогрессии опухоли;

• мультиплексная локализация генов и последовательностей ДНК на хромосомах, построение физических карт;

• детекция амплификации генов;

• детекция вирусных последовательностей и мобильных генетических элементов в ДНК;

• филогенетические исследования;

• анализ механизмов формирования хромосомных аномалий;

• анализ процессинга и транспорта РНК, количественная и качественная оценка мРНК или белков на клеточном уровне;

• анализ хромосомных аберраций в генетической токсикологии.

4. «Обратная» гибридизация (reverse painting). Метод направлен на установление происхождения маркерных хромосом и фрагментов хромосом, вовлеченных в структурные перестройки.

«Обратная» гибридизация проводится в несколько этапов:

а) изоляция маркерной хромосомы или фрагмента аберрантной хромосомы с помощью микродиссекции или проточной сортировки хромосом;

б) амплификация и мечение ДНК изолированного фрагмента – получение ДНК-зонда на основе библиотеки маркерной хромосомы или фрагмента;

в) гибридизация полученного ДНК-зонда на метафазной пластинке с нормальным кариотипом и идентификация локализаций сайтов гибридизационных сигналов.

5. Гибридизация в условиях различной жесткости. Метод направлен на быстрый и экономичный анализ хромосомных аберраций и основан на уникальной особенности организации -сателлитных последовательностей ДНК в разных хромосомах человека. В зависимости от числа мономеров, образующих повторяющуюся единицу, альфоидная ДНК подразделяется на несколько субсемейств, локализованных на различных группах хромосом. При гибридизации в условиях «низкой жесткости» определенные ДНК-зонды связываются с группой хромосом одного а-сателлитного субсемейства. Проведение последующей гибридизации в условиях «высокой жесткости» с хро-мосомоспецифичными ДНК-зондами одной группы обеспечивает точную идентификацию аномальной хромосомы.

6. Сравнительная геномная гибридизация (англ. Comparative Genomic Hybridization - CGH). Одновременно проводят гибридизацию in situ двух различных меченных ДНК, одна из которых выделена из анализируемой ткани и мечена одним флюорохромом или репортерными молекулами, а другая из кариотипически нормальной ткани и мечена другим флюорохромом. При проведении гибридизации анализируемая и референсная ДНК смешиваются в соотношении 1:1 и с добавлением избытка не меченной высокоповторяющейся Cot-1 ДНК наносятся на препараты с нормальными метафазными хромосомами. При наличии хромосомного дисбаланса в анализируемой ткани на препарате изменяется соотношение интенсивности свечения флюорохромов: при делеции фрагмента ДНК свечение в анализируемом участке будет сдвинуто в ту область спектра, которая характерна для флюорохрома, маркирующего нормальную ДНК. Напротив, при амплификации ДНК свечение смещается в область, характерную для анализируемой ДНК. Данный метод не требует проведения кариотипического анализа изучаемой ткани, поэтому имеет большую ценность при проведении исследования генетической структуры тканей, для которых существуют трудности в получении метафазных хромосом для анализа (например, солидные опухоли).

Применение CGH:

• цитогенетика опухолей; анализ гетерогенности клеточной популяции при раке; анализ опухолевой прогрессии;

• исследование фено-кариотипических корреляций;

• детекция амплификации и делеции генов; локализация кандидатных генов;

• скрининг структурных хромосомных аберраций;

• анализ интеграции вирусов и мобильных генетических элементов в геном.

7. Методы цветного сегментирования хромосом. Методы основаны на использовании библиотек регион-специфичных ДНК-проб (РСР), меченных различными флюорохромами. Полная разрешающая способность достигает 500 сегментов на гаплоидный набор хромосом.

Применение методов:

• анализ тонких структурных аберраций хромосом; идентификация микроделеций;

• изучение эволюции хромосом в пределах таксономических групп организмов (межвидовое цветное сегментирование хромосом).

8. Fiber-FISH. Данный метод представляет собой вариант флуоресцентной гибридизации in situ, проводимой на фибриллах ДНК, которые формируются на цитологических препаратах в свободном состоянии после обработки последних специфическими реагентами. Fiber-FISH обладает наивысшей разрешающей способностью из всех вариантов метода гибридизации in situ и позволяет идентифицировать последовательности ДНК протяженностью 1-150 килодальтон.

Применение метода:

• диагностика синдромов с микроаномалиями хромосом;

• анализ тонких внутрихромосомных аномалий;

• картирование генов путем непосредственного визуального определения порядка расположения отдельных участков ДНК в хромосоме относительно друг друга;

• анализ феномена экспансии нуклеотидных повторов.

Задание 1. Изучение кариотипов человека

1. Рассмотреть кариотипы человека (раздаточный материал).

2. По кариотипам определить следующее:

а) пол

б) нормальный кариотип или имеется патология, определить хромосомное заболевание.

в) формулу кариотипа

Задание 2. Составление и анализ идиограммы человека

На листе бумаги с обозначением групп хромосом разложить по указанным группам микрофотографии отдельных хромосом и определить пол и наследственное заболевание человека.

Работу проводить в следующей последовательности:

1. Выбрать самые маленькие акроцентрические хромосмы группы G (в женском организме их 2 пары аутосом, в мужском – 2 пары аутосом и У-хромосома.

2. Выбрать самые большие акроцентрические хромосомы группы Д – 3 пары.

3. Отобрать все хромосомы, которые меньше больших акроцентрических – 5 пар. Из них выбрать 2 пары самых маленьких метацентрических группы F. Оставшиеся 3 пары отнести к хромосомам группы Е.

4. Отобрать 3 пары самых крупных хромосом группы А. Из них две самые крупные метацентрические хромосомы относятся к 1-ой паре, две несколько менее метацентрические – к 2-ей паре хромосом, оставшиеся хромосомы – ко 2-ой паре.

5. Выбрать самые большие хромосомы группы В – 2 пары.

6. Все оставшиеся хромосомы относятся к хромосомам группы С – 8 пар в женском кариотипе и 7 пар и одна Х-хромосома – в мужском кариотипе.

7. По составленной идиограмме определить следующее:

а) это мужской или женский кариотип

б) это нормальный кариотип или имеется патология, определить хромосомное заболевание.

Записать результат анализа идиограммы и ответы на вопросы:

1. В каких группах находятся субметацентрические хромосомы?

2. В каких группах находятся метацентрические хромосомы?

3. В каких группах находятся акроцентрические хромосомы?

Задание № 3. Микропрепараты.