05. Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов.

Культивирование вирусов человека проводят с целью лабораторной диагностики вирусных инфекций, для изучения вопросов патогенеза и иммунитета, для получения диагностических и вакцинных препаратов. Так как вирусы абсолютные паразиты, то их культивируют в организме или в живых клетках.

Для культивирования вирусов используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбрионы, культуры клеток.

Лабораторных животных разными способами заражают (учитывают тропизм вирусов: ортомиксовирусами заражают интраназально, нейровирусами – субдурально). На основании типичных признаков заболевания и патоморфологических изменений органов животных можно судить о репродукции вирусов, т.е. проводить индикацию вирусов.

Куриный эмбрион является удобной моделью для культивирования вирусов, т.к. полости его стерильны, защищены твердой оболочкой. Индикацию вируса в курином эмбрионе проводят: по гибели эмбриона; помутнению хорион-аллантоисной оболочки; образованию бляшек на оболочке; в реакции гемагглютинации (происходит склеивание эритроцитов под действием гемагглютинина вирусов, который расположен в шипах суперкапсида).

Метод культур клеток. Для приготовления культур клеток используют различные ткани человека и животных. Чаще применяют культуры клеток из эмбриональных (куриные фибробласты, человеческие фибробласты) и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих активной способностью к росту и размножению.

Различают три типа культур клеток: однослойные культуры клеток; культуры суспензированных клеток; органные культуры.

Однослойные культуры клеток по числу жизнеспособных генераций разделяют на первичные или первично трипсинизированные (куриные фибробласты, человеческие фибробласты); перевиваемые (способны размножаться в лабораторных условиях длительное время); полуперевиваемые (способны размножаться в течение 40-50 пассажей).

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред – наличие 5-10 % сыворотки крови животных (телячьей, бычей, лошадиной), без наличия которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Они используются для накопления вирусов.

Некоторые вирусы размножаются в органных культурах – это кусочки органов, выращенные вне организма и сохраняющие структуру данного органа.

О размножении вируса в культуре клеток судят по следующим признакам: цитопатогенному действию (ЦПД); образованию в клетках включений; появлению бляшек; феномену гемадсорбции; цветной пробе.

Цитопатогенное действие может проявляться полной дегенерацией клеток – слущиванием клеток с поверхности стекла после их гибели (энтеровирусы полиомиелита, Коксаки); частичной дегенерацией – округлением клеток, слиянием и образованием симпластов (вирус кори).

Образование включений в клетках – это скопление вирионов или отдельных компонентов в цитоплазме или в ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения – тельца гварниери, вирусы герпеса, аденовирусы – внутриядерные включения.

Появление бляшек – зоны клеток, разрушенных вирусом (негативные колонии вирусов), обнаруживают в клеточных культурах, растущих на стекле и покрытых тонким слоем агара. Бляшки различаются по величине, форме, времени появления, поэтому данный тест используют для дифференциации вирусов.

Реакция гемадсорбции заключается в способности клеток, зараженных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты, потому что эти клетки несут на поверхности гемагглютинины вируса.

Цветная реакция основана на изменении цвета питательной среды с индикатором, используемой для культур клеток. При росте клеток, не пораженных вирусом, идет накопление продуктов метоболизма, которые изменяют цвет питательной среды. При репродукции вирусов в культуре нарушается метаболизм клеток, и среда сохраняет первоначальный цвет.

При отсутствии ЦПД можно поставить реакцию интерференйии – исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная), если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.