Лабораторна робота №4 тема: кількісне визначення активності ферментів

МЕТА: Закріпити знання про окисно-відновні ферменти, про механізм дії каталази, про рівень активності каталази у різних рослинах та її біологічне значення. Сформувати вміння екстрагувати фермент з рослинного матеріалу та кількісно визначати його активність, використовуючи титрування за методом перманганатометрії.

Теоретична частина

Методи кількісного визначення ферментів ґрунтуються на визначенні їх каталітичної дії. Як правило, активність ферментів визначають за зменшенням або збільшенням субстрату, на який діє фермент, за одиницю часу. Робота з ферментами проводиться в оптимальних для їхньої дії умовах (оптимальна концентрація субстрату, наявність коферментів, активаторів, при оптимальних значеннях рН, температури тощо). У досліджувані суміші додають коферменти, активатори та стабілізатори для запобігання денатурації ферментного білка.

Фермент каталаза за сучасною класифікацією відносять до класу оксидоредуктаз і позначають відповідно до сучасної номенклатури ЕС 1.11.1.6.

Реакція відновлення Оксигену маже відбуватися шляхом послідовних одно електронних стадій. При цьому проміжним продуктом може бути супероксид-аніон О , гідроген пероксид, гідроксильний радикал ОН. Такі частинки з високою реакційною здатністю потенційно отруйні для живих систем, особливо радикали О та ОН. Як вважають, ці частинки входять у групу мутагенних радикалів, які виникають при йонізуючій радіації.

Тому згідно з основними механізмами біологічного відновлення Оксигену такі процеси проходять через стадії з утворенням пероксиду водню Н₂О₂ або води Н₂О.

Для запобігання дії таких частинок існують ферментативні захисні механізми. Наприклад, супероксидний радикал перетворюється в гідроген пероксид за допомогою супероксиддисмутази згідно з реакцією:

О + О + 2Н⁺ Н₂О₂ + О₂.

Гідроген пероксид у свою чергу видаляється за допомогою каталази, яка каталізує реакцію:

Н₂О₂ + Н₂О₂ О₂ + Н₂О.

Організми, які не виробили таких механізмів захисту від токсичності кисню, можуть існувати лише в анаеробних умовах.

Каталазна активність спостерігається майже у всіх тваринних клітинах і органах. Печінка, еритроцити і нирки містять значні кількості каталаз. Ця активність також виявляється у всіх рослинах і в більшості мікроорганізмів, крім облігатних (обов’язкових) анаеробів. У кожному випадку каталаза, ймовірно, запобігає акумуляції шкідливого Н₂О₂, що утворюється при анаеробному окисленні відновлених флавопротеїнів та з О .

Каталаза нележить до ферментів з найбільшою молекулярною активністю. Одна молекула каталази може розкласти 44 000 молекул Н₂О₂ за секунду. Фактично фермент не потребує ніякої енергії активації. Каталаза реагує з пероксидом водню з утворенням відносно стабільного фермент-субстратного комплексу, структура якого не визначена.

Молекулярна маса каталази, її активність і деякі інші властивості хоча й незначною мірою, але відрізняються залежно від джерела одержання ферменту. у зв’язку з цим слід говорити про різні каталази. Ці відмінності обумовлені головним чином різницею у складі або структурі білкового компоненту. Але можливо, що в різних каталаз міститься неоднакова кількість гематинових груп. Так, каталаза з печінки бика має М(каталази) = 248 000 г/моль, і містить чотири гемових групи на молекулу ферменту. Її субодиниці не мають ферментативної активності окремо. Каталаза ж рослинного походження містить лише одну прогематинову групу.

Про різницю властивостей рослинної і тваринної каталази можна було б говорити тільки при порівнянні кристалічних препаратів ферменту, вільних від домішок, проте такі препарати поки що не отримані.

На основі робіт Чанса, Теорелла, Кейліна визначено такий механізм каталазної реакції:

R – FeOH + HOOH → R – FeOOH + H₂O (1)

У цій реакції відбувається взаємодія гематин гідроксиду з гідроген пероксидом, в результаті чого утворюється проміжний нестійкий пероксидний комплекс. По мірі його утворення він далі відновлюється другою молекулою пероксиду:

R – FeOOH + HOOH → R – FeOH + H₂O + O₂ (2)

Крім сполук, які блокують Ферум гематинової групи і таким чином ін активують усі гем протеїнові ферменти (сульфіди, ціаніди, гідроксиламін), каталаза пригнічується ще й сполуками, які не є специфічними отрутами: нітратами, хлорид-йонами, ацетат-йонами, фосфат-йонами, сульфат-йонами. Порівняно з іншими аніонами, найбільше гальмується активність каталази нітрат-аніонами. Вважається, що гальмівний вплив на активність каталази аніонів пояснюється заміщенням ними йона гідроксилу.

Кейлін і Хартрі показали, що каталаза може окиснювати етиловий і метиловий спирт, а також формальдегід за участі гідроген пероксиду, який утворюється в результаті дії флавопротеїнових оксидаз. Але при цьому концентрація гідроген пероксиду має бути дуже низькою в порівнянні з концентрацією ферменту, бо інакше донором Гідрогену для для відновлення комплексу R – FeOOH стає сам гідроген пероксид (див. реакцію 2), а не спирти. На основі досліджень Кейліна і Хартрі ряд вчених приписують каталазі пероксидазну функцію, але вона проявляє її лише до обмеженої кількості сполук: метиловий і етиловий спирти, формальдегід та нітрати.

Більшість дослідників вважають, що підвищений вміст хлорофілу у рослинах корелює з більш високою активністю каталази. У листях з повністю або частково порушеним синтезом хлорофілу знижується активність каталази.

Значною є роль каталази у забезпеченні молекулярним киснем тих тканин, куди доступ його з певних причин обмежений. Прикладом таких тканин може бути багатошарова паренхіма вегетативних запасних органів: бульби, коренеплоди тощо.

Крім того, біологічна роль каталази тісно пов'язана з нормально функціонуючою цитохромною системою. При комбінованій дії цитохрому С з каталазою мітохондрії більш активно синтезують АТФ при незначному підвищенні поглинання кисню. Каталазна активність мітохондрій пов'язана із забрудненням їх пероксисомами.