Лабораторна робота №1 тема: якісні реакції на амінокислоти та білки

МЕТА: Сформувати вміння хімічного виявлення деяких вільних амінокислот і їх залишків у складі білків, виявлення пептидного зв'язку в білках і пептидах. Ознайомити студентів з механізмами біуретової, нінгідринової, ксантопротеїнової реакцій, а також з механізмами реакцій Адамкевича, Паулі та нітропрусидної. Розвивати вміння використовувати ці кольорові реакції на амінокислоти та білки, складати рівняння відповідних реакцій.

Теоретична частина

Суміш амінокислот можна розділити наступними методами: а) хроматографія на папері, б) йонообмінна хроматографія, в) електрофорез.

Для аналітичного виявлення амінокислот застосовують нінгідрин:

нінгідрин

Нінгідрин окиснює амінокислоти, в результаті чого утворюються забарвлені продукти. Більшість ά–амінокислот при взаємодії з нінгідрином утворюють продукти синього чи фіолетового кольору. Пролін в реакції з нінгідрином дає жовте забарвлення.

Білки зазвичай існують у вигляді сумішей. Для їх розділення можна застосовувати методику фракційного осадження. Ця методика базується на використанні різної розчинності білків у водних розчинах солей або в органічних розчинниках, наприклад, у пропаноні (ацетоні) або в етанолі. При обережному доливанні одного з таких розчинників відбувається осадження певних білків, тоді як решта залишається в розчині. Регулюючи рН водного розчину білків, можна також досягати селективного осадження одного чи кількох з них.

Для розділення білків застосовуються не всі види хроматографії. Наприклад, хроматографія на папері викликає денатурацію білків. Однак для їх розділення можна використовувати колонкову хроматографію або йонообмінну хроматографію. В лабораторних дослідженнях з цією метою застосовують також електрофорез.

Білки не характеризуються чітко визначеними температурами плавлення, оскільки нагрівання викликає їх розклад. Для визначення ступеня чистоти білка і визначення його відносної молекулярної маси застосовують методику ультрацентрифугування. Ультрацентрифуги обертають зразки білкових розчинів з дуже великою швидкістю. Швидкість переміщення білків до кінця центрифужної пробірки і утворення осаду залежить від форми, щільності і відносної молекулярної маси білків. Швидкість осадження чистих білків відрізняється від швидкості осадження неочищених білків.

Для аналітичного виявлення білків у розчині можна використовувати біуретову пробу. При проведенні цієї проби до досліджуваного розчину доливають лужний розчин, який містить катіони купруму (ІІ). Присутність білків у досліджуваному розчині виявляється за появою фіолетового забарвлення. Біуретова реакція може бути також використана для визначення концентрації білків у розчині. Інтенсивність фіолетового забарвлення тоді виявляється кількісно за допомогою УФ – спектроскопа, і вона пропорційна концентрації білка.

Оскільки білки містять велику кількість здатних дисоціювати карбоксильних та аміногруп, вони є електролітами. При низьких значеннях рН білкового розчину в ньому переважають позитивно заряджені аміногрупи і, відповідно, білки перебувають в катіонній формі. За високих значень рН білкового розчину білки перебувають в аніонній формі. Подібно амінокислотам, білки також мають свої ізоелектронні точки – значення рН розчину, за якого білок (чи, відповідно, амінокислота) не має результуючого заряду (тобто кількість аміногруп рівна кількості карбоксильних, при чому сумарний позитивний заряд аміногруп рівний негативному заряду карбоксильних груп). У своїй ізоелектронній точці білок має мінімальну розчинність.

Таблиці 1. Ізоелектричні точки білків

Білок	Ізоелектрична точка (рН)
Пепсин	1,0
Альбумін крові	4,7
Інсулін	5,4
Гемоглобін	7,2
Рибонуклеаза	9,6
Лізоцим	11,1

Показники кислотності рК_а амінокислот при входженні їх у пептидний або білковий ланцюг можуть мінятися. Це пояснюється тим, що на дисоціацію амінокислоти, яка знаходиться в ланцюзі, можуть впливати сусідні заряджені групи та інші фактори, які обумовлюються найближчим оточенням амінокислоти.

Загалом слід зазначити, що специфічних реакцій на білки немає, і тому для ідентифікації білків застосовується кілька реакцій.

Розглянемо характеристику окремих аналітичних реакцій на білки та амінокислоти.

Біуретова реакція – процес виникнення комплексу, забарвленого в рожево-фіолетовий колір, при взаємодії пептидів та білків з купрум (ІІ) гідроксидом у лужному середовищі. Ця реакція не є специфічною, бо подібний комплекс утворюють не лише пептиди і білки, але й біурет:

Н₂N – C – N – C – NH₂,

││ │ ││

O H O

який також має пептидний зв'язок. Саме тому реакція отримала назву біуретової. Правильніше біло б сказати, що це реакція утворення пептидами і білками мідного комплексу – такого ж, як і з біуретом:

О^- О^-

│ Н H │

С = N N = C

/ \

HN O — Cu — O NH 2Na⁺

\ │ │ /

C = N N = C

H H

Мідний комплекс біурету

Нінгідринова реакція – це реакція ароматичного трикетону нінгідрину з речовинами, що мають вільні аміногрупи. Амінокислоти, пептиди і білки мають такі вільні аміногрупи і при реакції з нінгідрином утворюють барвник Руемана синьо-філотевого кольору. Як і біуретова, нінідринова реакція не є специфічною на амінокислоти, пептиди і білки. Будь-які речовини, що містять вільну аміногрупу, і навіть амоніак, дають позитивну реакцію з нінгідрином. Нуклеїнові кислоти теж реагують аналогічно. Тому говорять про нінгідринпозитивні сполуки.

Наведена схема характеризує реакцію нінідрину з амінокислотою:

Ксантопротеїнова реакція – це реакція нітрування ароматичних амінокислот в складі пептидів і білків, у результаті якої утворюються нітропохідні жовтого кольору. Реакція не специфічна, бо нітропохідні вільних ароматичних вуглеводнів теж мають таке забарвлення.

Реакція Адамкевича – це реакція на амінокислоту триптофан з гліоксалевою кислотою, в результаті якої відбувається конденсація двох залишків триптофану з утворенням сполуки, яка має довгий ланцюг спряжених подвійних зв'язків, який зумовлює виникнення червоно-фіолетового забарвлення.

Гліоксалева кислота за участі концентрованої сульфатної кислоти декарбоксилюється:

О О

││ ││

НООС – С СО₂ + Н – С

│ │

ОН Н

Утворений формальдегід вступає в реакцію конденсації з двома залишками триптофану у складі білка:

Реакція Паулі – це реакція азосполучення n-сульфофенілдіазоній- хлориду з ароматичними амінокислотами – як вільними, так і в складі пептидів і білків. Спочатку проводять на холоді діазотування сульфанілової кислоти, а потім реакцію азосполучення з ароматичними амінокислоттами у складі білків. З’являється оранжево-червоне забарвлення в результаті утворення азобарвника.

Нітропрусидна реакція – реакція на амінокислоту цистеїн, що містить сульфгідрильну групу – SH. При взаємодії натрій нітропрусиду зі сполуками, що містять групу – SH або – S², з’являється пурпурове забарвлення. Ця реакція на білки теж не специфічна.