ОСНОВЫ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДОВ

©по мотивам материалов П.А.Зыкина, Д. Сергеевой, К.Левчук, Е.Романовой, А.Давыдовой http:// wikipedia.org

Техники микроскопии: I.

Природа света – поперечная эл/маг волна . Колеблются векторы Е и В электрической и магнитной напряженности. Энергия света=hv/λ

Частота видимого света – от 400 до 700 нм. До него – ионизирующее излучение (0,01-1 нм), рентген (1-100 нм), УФ (100-400 нм); после – ИК (1 мм-1 см), радио (1м-1 км).

Свойства света:

1. Каждый цвет имеет определенную длину волны. Энергия света определенной длины волны=Е= hv/λ.

2. Световая волна имеет амплитуду. На ней основано понятие интенсивности. I=A^2, Контрастность=C=ΔI/I(фона).

3. Когерентные волны – однофазные, могущие интерферировать.

4. Монохроматичность света – равенство длин всех волн в нем. Фаза может различаться!

5. Поляризация света – колебание всех волновых векторов в нем в определенно плоскости или описание ими окружности (круговая поляризация) за период распространения волны.

6. Коллимированность – однонаправленность светового пучка.

Глаз – детектор световых волн. Характеристики глаза как оптического прибора:

1. Разрешение - характеристика, определяющая при каком минимальном расстоянии между объектами они еще различимы как два разных. Наилучшее разрешение 1-2' в зоне 1-1,15*.

2. Поле зрения – диапазон пространства, в котором еще можно увидеть объект. Общее поле зрения глаза – 125* по вертикали и 150* по горизонтали. Область желтого пятна – 8* по горизонтали и 6* по вертикали, вся остальная часть поля служит для грубого ориентирования в пространстве.

3. Чувствительность – минимальная интенсивность света, при которой регистрируется объект. Обеспечивается чувствительными клетками – палочками и колбочками.

4. Динамический диапазон – диапазон темных или светлых тонов, которые начиная с некоторого значения кажутся черными или белыми.

5. Спектральная характеристика – чувствительность глаза к различным длинам волн. Наиболее глаз чувствителен к излучению с длиной волны 555 нм днем (желто-зеленая часть спектра) и 515 нм в сумерках. Видимая область спектра – 380-780 нм. Количественное соотношение поглощения красной:зеленой:голубой волн примерно равно 12:6:1.

6. Временное разрешение – минимальное время, когда два объекта воспринимаются как разные.

Цветовые модели включают 2 палитры – аддитивную (RGB) и субстрактивную (CMYK). Базовые цвета RGB – красный, зеленый и синий, в смешении получают белый, желтый, фиолетовый и голубой цвет. Эта палитра – для флуоресцирующих объектов:мониторов, прозрачных пленок и т.д.

Базовые цвета CMYK – желтый, голубой и фиолетовый. Получают красный, зеленый, черный(темно-коричневый) и синий.

Не все цвета аддитивной палитры можно воспроизвести в субстрактивной палитре!

Характеристики источников света:

1. Ртутные лампы – 300 ч жизни, больше в УФ области, 5 пиков, дорогие

2. Ксеноновые лампы – 300 ч жизни, больше в ИК области, пики в ИК области, дорогие

3. Металл-галогеновые – 3000 ч, различно, менее дорогие

4. Галогеновые – 1000 ч, ИК область, нет пиков, недорогие

5. Накаливания – 1500 ч, ИК область, нет пиков, недорогие

6. LED – 10000ч, есть пики, низкая яркость.

Взаимодействие света с живыми клетками.

1. УФ:разрушает ковалентные связи, создает свободные радикалы. Средства борьбы:УФ-блокирующие фильтры, уменьшение яркости, увеличение объема среды и скорости перфузии, добавление аскорбиновой к-ты, сукцината, каталазы, глюкозы, понижение концентрации кислорода.

2. ИК:избыточный нагрев вплоть до денатурации. Средства борьбы:ИК-блокирующие фильтры (горячее зеркало, CuSO4), увеличение объема среды и скорости перфузии

Фильтры:

1. Нейтральные – нет спектральной фильтрации

2. Цветные стекла – широкая спектральная фильтрация, низкая цена, длительное время жизни, средняя износостойкость

3. Интерференционные – узкая спектральная фильтрация, средняя цена, среднее время жизни, низкая износостойкость. Принцип действия:2 металлические пластины с диэлектриком толщиной в ½ длины волны посередине. Входящий свет неподходящей длины волны отражается, а требуемый проходит дальше, становясь монохроматичным и удваиваясь.

Оптическая Плотность фильтра = ОП=log10(1/T)

Преломление и отражение света.

Закон преломления:n(куда падает)*sin(падающего)=n(откуда падает)*sin(преломленного)

n=c/V(света в среде)

Если коэффициент преломления материалов одинаков, то один не видно в другом (покровное стекло в иммерсионном масле)

Призма разлагает свет, т.к. разный коэффициент преломления для каждой длины волны.

Число Аббе – отношение дисперсии (разница преломления от длины волны) к преломляющей способности.

Геометрическая оптика.

Луч – абстрактный объект, перпендикулярный фронту световой волны.

Увеличение линзы – отношение расстояний от линзы до изображения к от линзы до предмета.

3 луча:через центр линзы, и 2 – параллельные ГОО, падающие в фокус.

Формула простой линзы: 1/f=1/a+1/b

Если объект:

1. на огромном расстоянии – точка

2. на расстоянии больше 2F – уменьшенное перевернутое изображение

3. на расстоянии 2F – равное перевернутое

4. на расстоянии между F и 2F – увеличенное перевернутое

5. на расстоянии F – ничего (лучи не сходятся)

6. на расстоянии меньше F – мнимое увеличенное

Реально после линзы изображение проходит через хрусталик, который на сетчатке дает действительное перевернутое увеличенное изображение.

В микроскопе изображение сначала формирует объектив, потом окуляр, а потом мнимое увеличенное изображение обрабатывает хрусталик.

Вопросы:

1. Спектр осветителя, использующего лампы накаливания или галогенные лампы отличается:

• Непрерывностью в диапазоне от ИК до УФ

• Значительным излучением в ИК диапазоне

• Значительным излучением в УФ диапазоне

• Зависимостью спектрального максимума излучения от напряжения

2. Электродуговые лампы (Xe, Hg)

• Ртутные лампы имеют значительное излучение в ИК диапазоне

• Ксеноновые лампы имеют значительное излучение в ИК диапазоне

• Ртутные лампы имеют значительное излучение в УФ диапазоне

• Ксеноновые лампы имеют значительное излучение в УФ диапазоне

• Ртутные лампы имеют значительные пики, один из которых 546 нм

• Ксеноновые лампы имеют значительные пики, один из которых 546 нм

3. Повреждающее действие света

• Основное повреждающее (фототоксическое) действие УФ излучение вызывает из-за разрыва ковалентных связей и образования свободных радикалов

• Основное повреждающее (фототоксическое) действие ИК излучение вызывает из-за разрыва ковалентных связей и образования свободных радикалов

• Основное повреждающее действие ИК излучение вызывает из-за тепловой денатурации белков

• Основное повреждающее действие УФ излучение вызывает из-за тепловой денатурации белков

4. Светофильтры (впишите названия фильтров)

• Для регуляции потока света от Xe,Hg ламп используются нейтральные фильтры

• Для выделения узкой полосы спектра (монохроматического света с точностью до 1 нм) из излучения источника используются интерференционные фильтры

• Учитывая комплиментарный характер субстрактивных цветов, для лучшей контрастности полупрозрачного образца, окрашенного в синий цвет, следует использовать желтый светофильтр

• Человеческий глаз лучше всего воспринимает монохроматический свет желто-зеленого цвета ( ~555 нм)

5. Использование цвета

• При просмотре изображения на мониторе компьютера используется аддитивная палитра

• При публикации изображений на бумаге используется субстрактивная палитра

• Все цвета из аддитивной палитры могут быть воспроизведены при помощи субстрактивной палитры (Нет)

6. Преломление

• Покровное стекло нельзя разглядеть когда оно помещено в сосуд с иммерсионным маслом

• Угол преломления луча зависит только от коэффициентов преломления двух сред

7. Геометрическая оптика

• Увеличение тонкой двояковыпуклой линзы зависит только от её фокусного расстояния (Нет)

• Условием создания увеличенного изображения объекта на экране за тонкой двояковыпуклой линзой является расположение объекта на расстоянии от F до 2F от линзы и экрана на расстоянии больше 2F от линзы с противоположной стороны

• Условием формирования изображения на сетчатке глаза является расхождение оптических лучей

• Условием видимости мнимого изображения при использовании тонкой двояковыпуклой линзы является расположение объекта на расстоянии от F до 2F от линзы

II.

Аберрации.

-это ошибки, погрешности изображения в оптической системе, вызываемые отклонением луча от направления, по которому он должен был бы идти в идеальной оптической системе.

Виды:

1. Хроматическая – паразитная дисперсия света, проходящего через оптическую систему. Изображения предмета в разных цветах не совпадают в пространстве изображений. Исправление – склейкой (ахроматом) – системой линз со сближенными фокусами лучей , разных цветов.

2. Сферическая аберрация – нарушение гомоцентричности пучков лучей от точечного источника, прошедших через оптическую без нарушения симметрии строения этих пучков. Исправление – применение оптических стекол с высокими показателями преломления, диафрагмирование объектива

3. Кома – каждый участок оптической системы, удаленный от ее оси на расстояние d (кольцевая зона), дает изображение светящейся точки в виде кольца, радиус которого тем больше, чем больше d; может рассматриваться как сферическая аберрация лучей, проходящих через оптическую ось системы.

4. Астигматизм – изображение точки, находящейся вне оси, и образуемое узким пучком лучей, представляет собой два отрезка прямой, расположенных перпендикулярно друг другу на разных расстояниях от плоскости безаберрационного фокуса. Корректируется подбором кривизны поверхностей и т.д.