6. Приготовление срезов.

Срезы с блоков изготовляются на микротоме. Наиболее распространены микротомы санный и замораживающий. В специальных устройствах микротома зажимается парафиновый блок и микротомный нож. Существует механизм, поднимающий объектодержатель с блоком на заданное количество микрометров. Это позволяет при каждом скольжении ножа в плоскости параллельной поверхности блока получать срезы толщиной 5-10 микрометров с парафиновых блоков.

7. Окрашивание.

Изготовленные на микротоме срезы окрашиваются. Перед окраской из парафиновых срезов обязательно удаляют парафин (растворением в ксилоле).

Окрашивание необходимо производить для того, чтобы отчетливо выявить под микроскопом тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах большинство структур одинаково преломляет свет, поэтому рассмотреть их не удается.

Выявление на срезе гистологических структур основано на неодинаковом их отношении к красителям. Одни структуры среза вступают в реакцию с кислыми красителями и ими окрашиваются (ацидофильные, оксифильные структуры), другие реагируют с основными красителями и окрашиваются преимущественно ими (базофильные структуры). Некоторые структуры окрашиваются и кислыми и основными красителями.

По происхождению различают краски естественные, к которым относятся краски растительного и животного происхождения, и краски искусственные. Краской растительного происхождения является гематоксилин, который добывается из кампешевого дерева, растущего в Америке и в Армении.

К краскам животного происхождения относится кармин, который добывается из насекомых кошенили, живущих на кактусовых деревьях в Мексике, Армении и др. В настоящее время большинство красок готовят синтетически (искусственные краски).

По окрашиванию определенных гистологических структур различают краски ядерные (окрашивание ядра), цитоплазматические (окрашивающие цитоплазму), и специальные, окрашивающие избирательно определенные структуры.

Ядерные краски – гематоксилин, кармин, сафранин, метиленовая синь, азур, тионин.

Цитоплазматические краски – эозин, пикрофуксин.

Существуют специальные краски и реактивы: судан Ш (окрашивает жир в оранжевый цвет), осмиевая кислота (импрегнируемый ею жир окрашиватся в черный цвет), резорцинфуксин Вейгерта (дает темно-синюю окраску эластических волокон), орсеин (окрашивает эластические волокна в бурый цвет). Метиленовый синий окрашивает нервные элементы в синий цвет, а при импрегнации серебром они приобретают коричневый цвет.

Чаще всего для окрашивания гистологических срезов применяется окрашивание раствором гематоксилина (приготовленным по методу Бемера) и 1-2% эозином.

8. Заключение среза.

Окрашенные и промытые в воде срезы во избежание помутнения обезвоживают в спиртах (70º, 96º), просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле, а затем на предметное стекло, где находится срез, помещают каплю бальзама и срез накрывают покровным стеклом. Бальзам представляет собой растворенную в ксилоле смолу одного из видов сосны, растущей в Канаде (канадский бальзам), смолу пихты (сибирский бальзам) или специальную синтетическую среду.

При исследовании биопсий с целью уточнения диагноза в гистологических лабораториях прибегают к ускоренной обработке материала. Кусочки тканей и органов при этом проходят те же этапы обработки, но за 5-7 дней. Иногда производится так называемая срочная биопсия, когда в течение 15-80 мин. материал фиксирует, получают срезы, окрашивают их и заключают. Быструю фиксацию производят в 10% формалине, подогреваемом пламенем горелки или с использованием СВЧ-печи. Уплотнения добиваются замораживанием (хлорэтилом, углекислотой или с помощью замораживающего микротома).

Примерная схема окраски препаратов гематоксилин — эозином

1. Парафиновые или замороженные срезы доводят до воды.

2. Окраска гематоксилином — в течении 3-5 минут.

3. Промывка в воде – 2 минуты.

4. Дифференцировка в спирте, подкисленном соляной кислотой (1% раствор соляной кислоты в 70 % спирте), несколько секунд с последующим восстановлением подщелоченной водой (около 1 минуты). Этот этап желателен, но не обязателен.

5. Промывка в проточной воде.

6. Ополаскивание дистиллированной водой.

7. Окраска 1 % эозином – 1-2 минуты.

8. Ополаскивание дистиллированной водой.

9. Обезвоживание в спирте – 2мин.

10. Просветление в ксилоле – 2 мин

11. Заключение среза – капля бальзама, покровное стекло.

МИКРОТОМЫ И РАБОТА С НИМИ

Микротом — специальное механическое устройство, предназначенное для приготовления гистологических срезов определенной толщины.

Отечественная промышленность выпускает три типа микротомов:

1) Санный (МС-2) — для получения парафиновых и целлоидиновых срезов;

2) для парафиновых срезов — предназначенный для получения серийных срезов материала, залитого в парафин;

3) замораживающий — микротом, имеющий специальное устройство для замораживания объекта, позволяющее резать нефиксированный, свежий материал.

Санный микротом (МС-2)

Прибор получил название благодаря тому, что нож и механизм подачи с зажимом для блока (объектодержателем) движутся на специальных салазках.

Основные части микротома: станина, механизм микро- подачи, механизм подъема, зажим для блоков (объектодержатель), ножевые салазки с ножедержателем.

Станина — массивная, чугунная основа, на которой монтируются все остальные узлы (1). В верхней части имеется паз для перемещения ножевых салазок, несущих ножедержатель (2). На боковой поверхности расположены наклонные направляющие (З) для перемещения салазок с механизмом подъема.

Механизм подъема состоит из трехгранной призмы (4), вставленной в специальную оправу (5), снабженную винтом для подъема призмы и рукояткой для ее закрепления в нужном положении. Оправа в свою очередь прочно прикреплена к салазкам, несущим механизм подъема.

Зажим для блоков (рамочный) состоит из внутренней (предназначенной для укрепления блока) и наружной рамок (б). Система рукояток и винтов позволяет изменять положение рамок в продольном и поперечном направлениях. От основания зажима отходит штифт, при помощи которого зажим для блоков вставляют в специальное гнездо, имеющееся в трехгранной призме.

Фиксирование на нужном уровне производят специальной рукояткой.

Ножевые салазки (7)—массивные устойчивые салазки, снабженные ручкой для передвижения и несущие на себе ножедержатель (8), который укрепляют на салазках специальной рукояткой, позволяющей менять горизонтальный угол расположения ножа. Сам же зажим снабжен подвижной цилиндрической втулкой (9), перемещение которой с помощью рычажка меняет угол наклона ножа.

Механизм микроподачи—наиболее сложный узел микротома. Он состоит из стержня (10), соединенного жестко с тягой (несущей на своем конце собачку), храповика и микровинта.

Автоматическая микроподача блока осуществляется следующим образом. При каждом обратном (холостом) ходе ножа ножевые салазки толкают стержень микроподачи и перемещают его. Это в свою очередь вызывает перемещение тяги, которая с помощью собачки поворачивает храповик. Вращение его через конические шестеренки передается микровинту (11), который через разъемную гайку (12) перемещает по наклонным направляющим снизу вверх салазки с зажимом для блока.

Система тяга — стержень каждый раз с помощью специальных пружин возвращается в исходное положение. Следовательно, чем больше стержень микроподачи выдвинут навстречу ножевьим салазкам, тем большим окажется его шаг (а соответственно, и поворот храповика), тем выше переместится блок и тем толще будет срез. Благодаря тому, что стержень имеет микрометрическую шкалу и специальный зажим, позволяющий менять его положение, можно точно регулировать степень подачи блока.

Так как с каждым срезом блок поднимается все выше, то периодически нужно отсоединять микровинт от разъемной гайки и опускать салазки с механизмом подачи в крайнее нижнее положение.

Помимо описанной конструкции микротома, существуют и другие. Имеются также варианты способа подачи блоков и устройства зажимов для них. Однако, несмотря на существующее разнообразие моделей микротомов, все они имеют общие принципы устройства, знание которых позволит успешно освоить их эксплуатацию.

Правила резания на микротоме

Общие сведения.

Предпосылкой для получения хороших гистологических срезов служит правильный выбор угла наклона ножа и угла резания .

Под углом наклона понимают угол, образуемый нижней поверхностью ножа с плоскостью резания. Наилучшим считается такой угол наклона, при котором плоскость заточки ножа расположена параллельно верхней поверхности блока. Обычно он равен 13—15°. Если нож установлен так, что угол наклона больше оптимального, то срез будет крошиться, если меньше — резка невозможна, так как лезвие ножа будет лишь скользить по поверхности блока.

Под углом резания подразумевают угол между длинной осью ножа и воображаемой линией, идущей через центр блока параллельно движению салазок, несущих нож. Величина угла резания зависит от свойств обрабатываемого материала: чем он мягче, тем угол меньше, и, наоборот, чем тверже, тем угол больше. При косом расположении ножа уменьшается сопротивление его режущего края поверхности блока, что облегчает резку мягких блоков. Максимальный угол резания равен 90°, минимальный — 20—30°.

Способ приготовления гистологических срезов зависит от вида заливки и свойств самого материала.