Введение в биотехнологию

Курс: 2. Дисциплина рассчитан на: 11 лекций (24 ч.). Кол-во лаб. занятий: 10 (20 ч).

Лекция 8. Введение в генетическую инженерию

Вопросы: Цель генной инженерии. Этапы становления генной инженерии. Методы генной инженерии. Методы переноса чужеродных генов в клетки. Рекомбинантные микроорганизмы. Получение рекомбинантных белков. Получение генетически модифицированных организмов. ДНК-технологии в растениеводстве. Трансгенез в растениеводстве.

Молекулярная биотехнология, (а) как ее видят авторы одноименного учебника Глик и Пастернак, это направление, возникшее на стыке биотехнологии и генной инженерии. (б) Другое определение – это направление, возникшее на стыке традиционной биотехнологии, молекулярной биологии и генетики. (в) Существует также определение молекулярной биотехнологии как объединения технологии рекомбинантной ДНК с промышленной микробиологией. Но такой молек. биотехнология была только на начальном этапе.

Главное направление генной инженерии - это перенос одного или нескольких генов из одного организма в другой. Центральным звеном генной инженерии является технология рекомбинантной ДНК. Изобретение способов конструирования новых организмов с чужеродными генами имел революционное значение для практической биологии. Как пишет, произошел переворот во взаимоотношения человека с живой природой.

Объектами генной инженерии являются: микроорганизмы, многоклеточные организмы, клеточные линии насекомых, растений, млекопитающих, вирусы бактерий, насекомых, растений, млекопитающих. В случае вирусов и организмов (а не клеток), генетически модифицированная самовоспроизводящаяся биологическая единица часто является конечным продуктом биотехнологии. Наиболее часто используемыми генно-модифицированными микроорганизмами являются E. coli и Sacch. cerevisiae.

Основные группы продуктов биотехнологии, связанных с генной-инженерией: (1) органы или биомасса с/х растений (урожай), (2) органы или биомасса с/х животных (продукция животноводства), (4) полезные метаболиты микроорганизмов, (5) вакцины, диагностические вещества (белки, используемые для иммунодиагностики), (6) лекарства, (7) штаммы микроорганизмов, создаваемые для биодеградации нежелательных веществ.

Если целью генной инженерии является создание организма-продуцента белка, то существуют 2 варианта реализации данной цели: (а) получение известного белка, только на основе организма, взятого в качестве биофабрики, который данный белок не вырабатывает, либо (б) получение искусственно сконструированного белка, т.е. того, который ранее не существовал в природе. Т.е. во втором случае имеет место белковая инженерия через посредничество белок-кодирующего гена.

С другой стороны, существуют 2 типа продуцентов чужеродных белков: секретирующие и несекретирующие белок в окружающую среду.

Главные этапы создания генно-модифицированных организмов:

(1) выбор собственно продукта, который будет получен на основе организма;

(2) выбор подходящего организма-продуцента;

(3) конструирование вектора – молекулярного переносчика ДНК в клетку хозяина;

(3а) выделение тотальной ДНК из клетки-инсточника гена;

(3б) выделение отдельно взятого гена;

(3в) подбор вектора;

(3г) введение в вектор гена, кодирующего фенотипический маркер;

(3д) «сшивка» гена с вектором;

(4) введение ДНК (вектора) в клетку (организм) хозяина;

(5) отбор успешно трансформированных клеток или организмов;

(6) обеспечение правильного функционирования нового гена в организме нового хозяина (оптимизация экспрессии);

(7) при необходимости – модификация клонированных (введенных в новый организм, чужеродных) генов на уровне нуклеотидов, с целью их улучшения.

Векторы: интегративные и неинтегративные.

Векторами,используемыми в различных организмах-продуцентах, являются:

для бактерий – вирусы (бактериофаги) и плазмиды

для грибов – плазмиды

для растений – плазмиды агробактерий; применяется также бомбардировка микрочастицами (биолистика). Материал – золото или вольфрам, диам. 0.4-1.2 мкм. Частицы покрывают молекулами ДНК. Обстрел такой дробью производится из порохового пистолета. Благодаря высокой плотности о большой скорости, микродробь пробивает клеточные стенки и мембраны, и ДНК затем каким-то неизвестным способом встранивается в геном.

для животных – вирусы

Краткая история и коммерциализация молекулярной биотехнологии.

Впервые перенос чужеродного гена в клетку (бактерии E. coli) был произведен в 1973 г.: Cohen, Boyer и Berg (Коэн, Бойер и Берг) ввели с помощью плазмидного вектора и заставили клонироваться фрагмент ДНК лягушки в клетке бактерии. Правда, этот ген не был белок-кодирующим, он кодировал рибосомальную РНК.

Надежды и опасения

Примечательно, что научное сообщество отреагировало на открытие новой технологией мораторием на некоторые генно-инженерные экперименты. Причем в числе ученых, наложивших подобный мораторий, были сами Коэн и Бойер. Ученые фактически испугались, что в результате объединения генов из разных организмов может привести к возникновению организма с нежелательными и опасными свойствами. Постепенно были согласованы условия безопасности проведения подобных работ, и излишние страхи по поводу генно-инженерных экспериментов улеглись.

Какие надежды и опасения связаны с генно-инженерными организмами:

надежды – диагностика, профилактика и лечение инфекционных и генетических заболеваний; повышение урожайности с.-х. культур путем создания устойчивых растений; создание микроорганизмов-продуцентов; создание улучшенных пород животных; переработка отходов;

опасения – не будут ли сконструированные организмы вредны для других организмов и окружающей среды; не приведет ли распространение генно-модифицир. организмов к сокращению существующего генетического разнообразия; правомочно ли изменять генетическую природу человека генно-инженерными методами; следует ли патентовать генно-инженерных животных; не нанесет ли молекулярная биотехнология ущерб традиционному сельскому хозяйству … и еще ряд опасений социального и экономического толка.

КАРТАХЕНСКИЙ ПРОТОКОЛ ПО БИОБЕЗОПАСНОСТИ к Конвенции о биологическом разнообразии

Монреаль, Канада, 29 января 2000 г. (adoption of the Cartagena Protocol and interim arrangements. Cartagena, Colombia 22 - 23 February 1999 and Montreal, Canada, 24 - 28 January 2000)

The Cartagena Protocol on Biosafety to the Convention on Biological Diversity is an international agreement which aims to ensure the safe handling, transport and use of living modified organisms (LMOs) resulting from modern biotechnology that may have adverse effects on biological diversity, taking also into account risks to human health. It was adopted on 29 January 2000 and entered into force on 11 September 2003.

Статья 1. Цель

В соответствии с принципом принятия мер предосторожности, содержащимся в Принципе 15 Рио-де-Жанейрской декларации по окружающей среде и развитию, цель настоящего Протокола заключается в содействии обеспечению надлежащего уровня защиты в области безопасной передачи, обработки и использования живых измененных организмов, являющихся результатом применения современной биотехнологии и способных оказать неблагоприятное воздействие на сохранение и устойчивое использование биологического разнообразия, с учетом также рисков для здоровья человека и с уделением особого внимания трансграничному перемещению.

Статья 2. Общие положения

1. Каждая Сторона принимает необходимые и соответствующие правовые, административные и другие меры для выполнения своих обязательств, предусмотренных в рамках настоящего Протокола. 2. Стороны обеспечивают, чтобы получение любых живых измененных организмов, их обработка, транспортировка, использование, передача и высвобождение осуществлялись таким образом, чтобы не допускались или были уменьшены риски для биологического разнообразия, с учетом также рисков для здоровья человека. 3. Ничто в настоящем Протоколе никоим образом не наносит ущерба суверенитету государств в отношении их территориального моря, определенного в соответствии с международным правом, и их суверенным правам и юрисдикции, которыми государства обладают в своих исключительных экономических зонах и в границах их континентальных шельфов в соответствии с международным правом, а также осуществлению морскими и воздушными судами всех государств навигационных прав и свобод, предусмотренных международным правом и закрепленных в соответствующих международных документах. 4. Ничто в настоящем Протоколе не интерпретируется как ограничение права Стороны принимать меры, обеспечивающие более высокий уровень защиты в отношении сохранения и устойчивого использования биологического разнообразия, чем тот, который предусмотрен в настоящем Протоколе, при условии, что такие меры соответствуют цели и положениям настоящего Протокола и согласуются с другими обязательствами данной Стороны в рамках международного права. 5. Стороны поощряются принимать в соответствующих случаях во внимание имеющиеся экспертные знания, договоренности и результаты работы, проделанной на международных форумах, обладающих компетенцией в области рисков для здоровья человека.

Механизм мер по биобезопасности: (1) сбор сведений о создании генно-инженерных организмов в данном государстве; (2) контроль за мерами их поддержания в замкнутых системах; (3) проверка безопасности организма для биоразнообразия в случае высвобождения; (4) контроль трансгарничного перемещения генно-инженерных организмов.

Коммерциализация

Конечной целью любых разработок в области молекулярной биотехнологии является создание коммерческого продукта. Историю промышленного применения генно-модифицированных организмов можно начать с успеха компании Genentech (США) в 1980 г. на фондовой бирже, а именно, за один день торгов цены на ее акции поднялись в 2.5 раза. Цены на акции компании рекордно подскочили. Компания Genentech была первой, которой удалось выделить ген человеческого инсулина, ввести его в геном Escherichia coli и заставить клетки бактерии производить инсулин. После процедур очистки бактериальный инсулин применялся для лечения диабета в тех случаях, когда у больных была аллергия на свиной инсулин. Успех компании Genentech был своего рода оценкой потенциала, заложенного в технологии рекомбинантных ДНК. После успеха Genentech, в начале 1980-х годов в США было создано около 200 мелких биотехнологических компаний. К 1985 г. в США их стало более 400, и многие из них включили в свое название слово «ген», обозначив своего рода принадлежность к генному «цеху». К концу 1990-х годов в США было уже 1500 биотехнологических компаний, и более 3000 во всем мире. К 1995 г. в странах Европы было создано более 600 биотехнологических компаний. Кроме того, можно назвать крупные химические и фармацевтические компании, сделавшие вклад в развитие биотехнологии с использованием генно-инженерных объектов, например, Monsanto, Merck. Относительно недавно появились компании, которые выпускают полученные генно-инженерными методами антитела, предназначенные для лечения инфекционных заболеваний и рака.

Большая часть коммерческих разработок в области молекулярной биотехнологии приходится на США. Правительство Японии объявило биотехнологию национальным приоритетом и «стратегической индустрией», и здесь также развиваются крупные б/т корпорации. В странах с менее успешной экономикой инвестором биотехнологической отрасли служит государство.