Лекция 5. Роль межклеточного матрикса в регуляции метаболизма сердца и сосудов.

5.1.Механорецепторы. Структура и свойства интегринов.

5.2.Адгезивные белки межклеточного матрикса. Фибронектин. Ламилин.

5.3.Структурные белки межклеточного матрикса. Коллаген. Эластин.

5.4.Гликозаминогликаны межклеточного матрикса. Структура и классификация.

5.5.Структура протеогликанов, отличие от гликопротеинов.

5.1.Механорецепторы. Структура и свойства интегринов.

Тактильные механорецепторы сосредоточены в наружных покровах животных и человека, они воспринимают прикосновение.

Барорецепторы расположены в стенках кровеносных сосудов, сердца, полых гладкомышечных органов; они реагируют на растяжение вследствие повышения давления крови, скопления газов в желудке или кишечнике и т. п.

Проприорецепторы — сосредоточены в мышечно-суставном аппарате — реагируют на растяжение при сокращении или расслаблении скелетных мышц.

Вестибулорецепторы (или механорецепторы вестибулярного аппарата) реагируют на ускорения, вибрации, наклон тела или головы.

Обнаружены два типа Мчк (механочувствительных каналов) : МчкВ (каналы высокой проводимости) - с проводимостью порядка 3000 пСи и МчкМ каналы малой проводимости - с проводимостью около 1000 пСи. Если латеральное натяжение фиксируемой мембраны увеличивается вследствие ее всасывания в микропипетку, каналы открываются. То, что высокая и низкая проводимости МчкВ и МчкМ - следствие активности двух разных типов каналов, а не разных состояний одного и того же доказывается с помощью нокаута гена МчкВ . Характеристики проводимости МчкМ определяются именно в таких "нокаутных" бактериях. Натяжение, требуемое для открывания этих каналов, составляет прибл. 0,7 от того, которое необходимо для открывания МчкВ. Существуют и данные о присутствии в мембране каналов с еще меньшей проводимостью. Анализ МчкВ был продолжен с помощью сложной техники современной молекулярной биологии. Метод состоит в включении фрагментов мембраны в липосомы из фосфолипидов другого вида и повторной локальной фиксации потенциала, чтобы подтвердить наличие механочувствительных каналов. Белки из таких липосом могут быть экстрагированы умеренными детергентами и очищены с помощью биохимических методик, каждая стадия тестируется методом фиксации потенциала и так до получения чистой фракции каналов. Выяснилось, что молекулярная масса канала Mr составляет около 17 кДа. N-конец аминокислотной последовательности 17 КДа-белка сиквенирован, а затем в полной к настоящему времени базе данных генома E.coli проведен поиск гена, содержащего соответствующую последовательность нуклеотидов. Эта последовательность была обнаружена в гене, функция которого ранее не была известна. путем сложных молекулярно-биологических процедур ген был экспрессирован, а полученный белок встроен в фосфолипидные липосомы, которые, будучи локально фиксированы по потенциалу, продемонстрировали наличие механочувствительных каналов. Поскольку МчкВ удалось выделить и встроить в искусственные фосфолипидные липосомы, стало возможным детально изучить биофизические характеристики каналов. Как и большинство других мембранных каналов, они обладают различными состояниями проведения ( рис. 5.2 ). Существует и строгая их зависимость от латерального натяжения мембраны. Зависимость вероятности открытого состояния канала от натяжения описывается крутой сигмовидной кривой. Данных об их ионной селективности нет, и это, вместе с большой проводимостью канала, предполагает наличие широкой водной поры

Изоляция белка МчкВ и идентификация соответствующего гена позволила молекулярным биологам определить их молекулярную структуру. Это - сравнительно небольшой белок из 136 аминокислотных остатков. Изучение аминокислотной последовательности показало, что на N-конце находится участок гидрофильных остатков, затем - сильно гидрофобных аминокислот (19 - 49), далее - еще один гидрофильный (50 - 69), второй гидрофобный сегмент (72 - 100) и, наконец, гидрофильная последовательность до С-конца. Тщательное изучение физико-химических характеристик полипептила показывает, что два гидрофобных сегмента образуют альфа-спирали (М1 и М2), пронизывающие мембрану. И N-, и C-концы локализованы внутриклеточно, и есть основания полагать, что существует короткий спиральный участок (S3) во внеклеточном сегменте между М1 и М2 ( рис. 5.3а ). По аналогии с другими потенциал-зависимыми каналами, такими, как Na+-канал , было сделано предположение, что участок S3 образует часть белка, выстилающую канал. Действительно, как мы увидим ниже, накапливаются данные исследований мутагенеза, подтверждающие такое предположение. Одиночный белок МчкВ не в состоянии сформировать канал с воротными свойствами, характерными для природного МчкВ. Работоспособный канал должен быть мультимерным комплексом . Это соответствует структуре многих других канальных белков (см. БАЗОВЫЕ КОМПОНЕНТЫ СЕНСОРНЫХ СИСТЕМ ). Хотя н екоторые дебаты на эту тему и продолжаются, общее мнение в настоящее время сводится к тому, что МчкВ состоит из шести субъединиц, сгруппированных вокруг центрального водного канала ( рис. 5.3б ). Когда мембрана подвергается механическому напряжению, субъединицы несколько удаляются друг от друга и канал, образуемый ими, открывается. Выделение белка МчкВ и его гена mscl открыло возможность генетических исследований структурно-функциональных продолжаются и сейчас получены некоторые интересные сведения. Один из аминокислотных остатков в "нижней части" периплазматической спирали S3 кажется особенно критичным. Это глютаминовый остаток в положении 56 (Q56)(см. рис. 5.3.а ). Различные замещения аминокислотных остатков в этом положении значительно увеличивают время открытого состояния канала при данном значении механического напряжения. Некоторые замены, в частности замена в этом положении глютамина на пролин (принятое у молекулярных биологов обозначение - Q56Р), делает чувствительность канала к напряжению поверхности значительно ниже, чем та, которая требуется для его открывания. Замены в других частях цепи канального белка, хотя и не имеют таких драматических эффектов, однако изменяют его функцию интересным и наводящим на размышления образом. Продолжающиеся и сегодня генетические исследования структурно-функциональных взаимоотношений в конце концов приведет к пониманию организации механочувствительных каналов во всей полноте их молекулярных и даже атомарных деталей.

Интегрины представляют собой поверхностные гетеродимерные белки, которые обеспечивают адгезию клеток к компонентам внеклеточного матрикса и иногда к другим клеткам. Многие интегрины проявляют сродство к гликопротеидам и базальной мембраны, и внеклеточного матрикса. Утрата некоторых интегринов (при раке молочной железы , раке предстательной железы , раке толстой кишки ) или их избыток (при меланоме , плоскоклеточном раке полости рта , носоглотки , гортани ) сопряжены с высокой степенью злокачественности опухоли. Связывание интегринов с лигандами и сближение клеток необходимы для перестройки базальной мембраны, идущей при ангиогенезе . Взаимодействие интегринов с белками внеклеточного матрикса в некоторых случаях препятствует апоптозу . Так, клетки меланомы избегают апоптоза в дерме за счет связывания альфа(ню)-бета3-интегрина с коллагеном. Нейтрализация этого интегрина антителами, напротив, способствует апоптозу. Таким образом, информация, которую интегрины передают от внеклеточного матрикса внутрь клетки, в одних случаях стимулирует адгезию и миграцию опухолевых клеток, в других - приводит к их гибели. Иными словами, интегрины играют роль своеобразного "переключателя", определяющего дальнейшую судьбу опухолевой клетки.

Интегрины ( Buck C.A., Horwitz A.F., 1987 ) - семейство родственных белков с М.м. 100-160 кД, способных узнавать в матриксных белках пептид RGD.

Это большое семейство трансмембранных линкерных белков , являющихся расположенными на клеточной поверхности рецепторами большинства белков внеклеточного матрикса , включая коллаген , фибронектин , витронектин , ламинин . Одновременное множественное, но слабое связывание интегринов со своими лигандами позволяет клеткам исследовать свое окружение, сохраняя способность двигаться, что было бы невозможно при слишком прочных взаимодействиях. Интегрины работают как рецепторы клеток и ЕСМ белков . Клеточное соединение с помощью интегринов быстрое - в течение минут ( Giancotti F.G., ea, 1990 ).

Интегрины - это молекулы межклеточной адгезии , которые присутствуют на поверхности различных клеток, в том числе и лейкоцитов . Они участвуют в адгезии лейкоцитов к внеклеточному матриксу и к эндотелию. Все белки, входящие в это крупное семейство, состоят из двух нековалентно связанных полипептидых цепей (альфа и бета). Обе цепи пронизывают клеточную мембрану. Альфа цепь содержит 3 или 4 тандемных повтора мотива связывающего двухвалентные ионы и нуждаются в Mg и Ca для функционирования.Альфа цепи при связывании с бета цепью дают функциональный рецептор ( Giancotti F.G., ea, 1990 ). Бета цепь имеет функциональное значение и интегрины классифицируются по ним. Так интегрины с бета 1 или бета 3 цепью преимущественно вовлечены во взаимодействие клетки - ЕСМ. Интегрины с бета 2 цепью преимущественно вовлечены во взаимодействие лейкоцитов между собой . Семейство интегринов делят на три основных подсемейства по типу бета-цепи (бета1, бета2 и бета3). Тип альфа-цепи не так важен для функциональной активности.

Интегрины бета1 участвуют, в основном, в связывании клеток со структурами внеклеточного матрикса; бета-цепь представляет собой маркер CD29 .

Интегрины бета2 участвуют в адгезии лейкоцитов к эндотелию или другим клеткам иммунной системы; бета-цепь представляет собой маркер CD18 .

Интегрины бета3 (цитоинтегрины) участвуют в слипании тромбоцитов с нейтрофилами в очагах воспаления или местах повреждения сосудов.

Из этой простой схемы есть несколько исключений и, кроме того, описаны дополнительные бета-цепи (например, бета7).

Каждая бета-цепь может ассоциировать с одной из различных альфа- цепей, в результате чего образуются различные молекулы адгезии.

Способность интегринов связываться со своими лигандами зависит от двухвалентных катионов.

К наиболее важным для миграции клеток относятся следующие интегрины.

VLA-1 (альфа1бета1) экспрессируется на T-клетках и фибробластах.

VLA-2 (альфа2бета1) экспрессируется на активированных T-клетках и тромбоцитах . Лигандом для этого интегрина является коллаген.

VLA-3 (альфа3бета1) экспрессируется на почках и щитовидной железе. Лиганды, с которыми связывается этот интегрин, - ламинин, коллаген, фибронектин.

VLA-4 (альфа4бета1) экспрессируется на лимфоцитах и некоторых типах фагоцитов . Лиганды: VCAM-1 , фибронектин.

VLA-5 (альфа5бета1) экспрессируется на некоторых типах лейкоцитов и тромбоцитах . Лигандом является фибронектин.

VLA-6 (альфа6бета1) экспрессируется на многих типах клеток. Лиганд - ламинин.

LPAM-1 (альфа4бета7) экспрессируется на некоторых субпопуляциях T-клеток . Лиганды: MAdCAM-1 ( VCAM-1 ).

LFA-1 (альфаLбета2) экспрессируется на большинстве типов лейкоцитов . Лиганды: ICAM-1 , ICAM-2 ( ICAM-3 )

CR3 (альфаMбета2) экспрессируется на мононуклеарных фагоцитах , нейтрофилах . Лиганды: C3b , C4b , ICAM-1 .

CR4 (альфаXбета2) экспрессируется на макрофагах . Лиганды C3b , C4b и, возможно, ICAM-1 .

Многие из молекул лейкоцитарной поверхности, обеспечивающих взаимодействие с внеклеточным матриксом, входят в группу бета1- интегринов. Они названы "очень поздними антигенами" (very late antigens - VLA ), поскольку впервые были идентифицированы на поверхности T-клеток в поздней стадии активации. Теперь все бета1-интегрины называют VLA, хотя большинство их присутствует не только на лимфоцитах. Эта группа включает рецепторы для коллагена, ламинина и фибронектина.

Альфа цепь содержит 3 или 4 тандемных повтора мотива связывающего двухвалентные ионы и нуждаются в Mg и Ca для функционирования.Альфа цепи при связывании с бета цепью дают функциональный рецептор ( Giancotti F.G., ea, 1990 ). Бета цепь имеет функциональное значение и интегрины классифицируются по ним. Так интегрины с бета 1 или бета 3 цепью преимущественно вовлечены во взаимодействие клетки - ЕСМ. Интегрины с бета 2 цепью преимущественно вовлечены во взаимодействие лейкоцитов между собой .

К середине 90-х гг было известено 14 видов альфа субъединиц и 8 видов бета субъединиц , а также 20 из 112 теоретически возможных альфа/бета комбинаций. Каждая субъединица пронизывает мембрану один раз и, в основном, почти вся молекула находится вне клетки (за исключением бета 4). В цитоплазме находятся короткие хвосты, размером от 15 до 77 аминокислот, не обладающие какой-либо энзиматической активностью. Внутриклеточный домен многих интегринов взаимодействует с цитоскелетом , например, в фокальных контактах с актиновыми филаментами ( Springer T.A., 1990 , Giancotti F.G., ea, 1990 ).

В середине 90-х гг был известен 21 интегрин. Экспрессия индивидуального интегрина обуславливает определенные адгезионные свойства какой-либо группы клеток. Имеется по крайней мере 3 семейства интегринов ;

первое семейство включает рецептор фибронектина (фибробласты) и еще 5 других белков.

второе- включает рецептор тромбоцитов IIбета/IIIальфа, связывающий некоторые компоненты матрикса, в том числе и фибриноген .

Третье семейство - это интегрины на поверхности лейкоцитов ( LFA-1 , Mac-1 ).

Клеточно-матриксные контакты образованные с помощью интегринов хорошо изучены в гладкомышечных клетках и в местах прикрепления культивируемых фибробластов к внеклеточному матриксу.

СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ РЕЦЕПТОРОВ ТРОМБОЦИТОВ

Рецепторы тромбоцитов — гликопротеины мембраны, боль­шинство из которых относят к семейству так называемых интегринов. Интегрины — гетеродимерные молекулы, состоящие из семейства а- и р-субъединиц, различные комбинации которых и служат специфическими рецепторами для различных лигандов. Интегрины находят на поверхностях практически всех клеток, они участвуют во многих физиологических реакциях. Извест­но несколько интегринов, участвующих в адгезии тромбоцитов: гликопротеин I_a/II_a (ct₂Pi) — основной рецептор для коллагена, гликопротеин I_c/II_a («5Р1) — для фибронектина, o^Pi — рецептор для ламинина, сс5р3 — рецептор для витронектина. Последний ре; цептор способен узнавать и другие лиганды: фибриноген, фФВ, связывающиеся и с рецептором Пь/Ш_а. Известно несколько ре­цепторов, по структуре не относящихся к интегринам, участву­ющих в адгезии тромбоцитов: гликопротеин IV — рецептор для коллагена и тромбоспондина, а также гликопротеин 1^, связыва­ющий фФВ.

Таким образом, за процесс адгезии тромбоцитов ответственно несколько рецепторов мембраны тромбоцитов, среди которых есть представители семейства интегринов и других семейств. Однако основной рецептор, узнающий наибольшее количество лигандов, а именно фибриноген, фибронектин, фФВ и витро-нектин и участвующий в процессе агрегации, — гликопротеин Пь/Ша («2Р3) поверхностной мембраны тромбоцитов.

Нь/Ша-рецептор тромбоцитов — типичный представитель семейства интегринов. Его а-субъединица, или гликопротеин lit, (молекулярная масса 36 кД), состоит из тяжелой и легкой цепей. Легкая цепь имеет короткий цитоплазматический хвост, транс­мембранную часть и короткий внеклеточный домен. Тяжелая цепь расположена снаружи клетки. р-Субъединица, или глико­протеин Ш_а (молекулярная масса 92 кД), состоит из единствен­ного полипептида (762 аминокислоты) с коротким цитоплаз­матический хвостом, трансмембранной частью и большим вне­клеточным доменом. Субъединицы нековалентно связаны друг с другом, для сохранения гетеродимерной структуры необхо­дим кальций. Пь/Ша-рецепторы наиболее распространены, на поверхности одного тромбоцита содержится примерно 50000 ре­цепторов. Щ/Ша-рецепторы тромбоцитов изучены в наиболь­шей степени благодаря проведению исследований по изучению тромбастении Глянцмана — врожденной патологии, связанной с отсутствием или резким снижением количества Пь/Ша-рецеп-торов. Исследования крови больных с тромбастенией Глянцмана показали, что 11ь/1Н_а-рецепторы способны связываться не только с фибриногеном и тем самым осуществлять процесс агрегации тромбоцитов, но и с другими адгезивными гликопротеинами: фибронектином, фФВ, витронектином, в большей степени отве­чающими за адгезию тромбоцитов к субэндотелиальным струк­турам.

Механизм действия 11ь/Ш_а-рецептора заключается в его спо­собности узнавать 2 характерные аминокислотные последова­тельности. Первая состоит из аминокислот Arg-Gly-Asp, она об­наружена в фибронектине, фФВ, витронектине, а также и в а-це-пях молекул фибриногена, причем на каждую половину молеку­лы фибриногена приходится по 2 ключевые последовательности Arg-Gly-Asp. Следует подчеркнуть, что ключевая последова­тельность Arg-Gly-Asp узнаваема большинством представите­лей семейства интегринов. Тонкие механизмы взаимодействия Пь/П1_а-рецепторов с адгезивными молекулами до конца не изуче­ны, но очевидно, что пептиды или мелкие молекулы, содержащие ключевую последовательность аминокислот Arg-Gly-Asp, могут быть потенциальными ингибиторами взаимодействия Пь/Ш_а-ре-цепторов тромбоцитов с фибриногеном.

Вторая цепочка аминокислот, узнаваемая II_b/III_a-рецептора­ми тромбоцитов, — Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val. Она находится в карбоксильном конце у-цепей фибриногена. В отличие от це-« почки Arg-Gly-Asp цепочку Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val обна-* ружили только в молекуле фибриногена и, вероятно, именно* в этом месте фибриноген связывается с Пь/Ша-рецепторами тромбоцитов. Взаимосвязь между 2 цепочками до конца не яс-1 на. Показано, что пептиды из у-цепей фибриногена ингибируюч! связывание фибронектина и фФВ с тромбоцитами. Это может быть связано с тем, что места на 11ь/1П_а-рецепторах, узнающие как первую, так и вторую цепочку, частично перекрываются, или] же с аллостерическим взаимодействием участков рецепторов^ узнающих 2 упомянутые цепочки аминокислот. Предполагают, что обе цепочки аминокислот взаимодействуют с несколькими участками 11ь/Ш_а-рецептора.