2.6.Роль цГмф и протеинкиназы g в регуляции кальциевого обмена в кардиомиоцитах и гладкомышечных клетках.

цГМФ является соединением влияющим на кальциевый обмен. Синтез осуществляет гуанилатциклаза . Гуанилатциклаза контролируется рядом внеклеточных факторов. Активность гуанилатциклазы возрастает под влиянием так называемого эндотелиального расслабляющего фактора EDRF , который синтезируется из аргинина в клетках эндотелия кровеносных сосудов и в некоторых других клетках и представляет собой окись азота - NO . Путем образования эндогенного NO действует широко применяемые лекарства - нитроглицерин , нитропруссид и нитросорбид . NO и другие нитросоединения активируют цитозольную форму гуанилатциклазы . Эта изоформа ингибируется известным красителем метиленовым голубым (или метиленовой синькой).

Еще одним активатором синтеза цГМФ является предсердный натрийуретический фактор ( ANF ). Рецептор ANF насквозь пронизывает плазматическую мембрану и в своей цитозольной части имеет домен, обладающий гуанилатциклазной активностью. Гуанилатциклаза активируется при связывании ANF с рецептором. Гуанилатциклазная активность рецептора ANF не ингибируется метиленовой синькой.

Помимо ANF и NO внутриклеточную концентрацию цГМФ повышают агонисты, активирующие фосфоинозитидный обмен и увеличивающие Ca . Эта закономерность была обнаружена еще в 1975 г. Робертом Мичеллом ( Michell, 1975 ), однако механизм повышения уровня цГМФ под действием ионов Са был установлен значительно похже. Вызванное Са-мобилизующими агонистами увеличение концентрации цГМФ наступает с существенным лаг-периодом ( Nakatsu, Diamond, 1989 ), так как активации гуанилатциклазы предшествуют следующие процессы: ионы Са в цитоплазме активируют ферментативное превращение аргинина в NO, NO присоединяется к гуанилатциклазе и стимулирует синтез цГМФ.

Исследование роли цГМФ в регуляции обмена внутриклеточного Са были начаты на препаратах гладкомышечных клеток . Еще в 1977 году на основании данных о мощном сосудорасслабляющем действии нитропруссида было предположено, что цГМФ препятствует рецепторзависимому повышению Ca, благодаря чему подавляются вызванное гормонами сокращение гладкомышечных клеток и возбуждение других типов клеток ( Schultz et al., 1977 ). С появлением флуоресцентных кальциевых зондов было прямо показано, что факторы, активирующие синтез цГМФ, либо проникающие в клетку аналоги цГМФ вызывают снижение Ca (табл.13) . В отличие от цАМФ цГМФ действует всегда в одном направлении - в сторону подавления рецепторзависимого подъема Ca .

Считается, что Са-блокирующие эффекты цГМФ опосредованы цГМФ-зависимой протеинкиназой ( Waldman, Murad, 1987 ). Воздействие цГМФ, по имеющимся данным, направлено на разные звенья системы регуляции Ca. Существует довольно много данных, показывающих, что цГМФ активирует и Ca ( Simon, Chap, 1989 ) и при оценке действия 8-Br-цГМФ на индуцированный ФАТ входящий ток натрия ( рис.76 , Чеглаков, Авдонин, неопубликованные данные) было показано, что цГМФ блокирует каналы плазматической мембраны.

На препарате гладкомышечных клеток кровеносных сосудов Ткачук и др. показали, что активирующие гуанилатциклазу нитросоединения блокируют активацию эндотелином гидролиза фосфоинозитидов и повышение Ca. Имеются сообщения о блокировании предсердным натрийуретическим фактором и 8-Br-цГМФ потоков Са через сарколемму плазматических клеток сосудов ( Taylor, Meisheri 1986 ; Meyer-Lehnert et al., 1987). Таким образом, обобщая приведенные данные, можно заключить, что повышение цГМФ приводит к снижению Ca как за счет активации процесса удаления Са из цитоплазмы, так и за счет блокирования механизмов рецепторзависимого поступления этого иона в цитоплазму клеток.

Серин-треониновые протеинкиназы фосфоририруют гидроксильную группу в остатках серина или треонина.

Активность этих протеинкиназ регулируется несколькими событиями, а также некоторыми химическими сигналами, в том числе, cAMP, cGMP, диацилглицеролом, Caкальмодулином.

Серин/треониновые протеинкиназы фосфорилируют остатки серина или треонина в консенсусных последовательностях, которые образуют фосфоакцепторный сайт. Эта последовательность остатков аминокислот в молекуле субстрата, позволяет осуществлять контакт каталитической щели протеинкиназы с фосфорилируемой областью. Эта особенность делает киназу специфичной не к какому-либо определенному субстрату, но к специфичному семейству белков с одинаковыми консенсусными последовательностями. В то время, как каталитические домены этих протеинкиназ высококонсервативны, последовательности узнавания отличаются, обуславливая узнавание разных субстратов.

Киназа фосфорилазы была открыта Кребсом в 1959 году и является первым описанным ферментом семейства серин/треониновых протеинкиназ. Киназа фосфорилазы превращает неактивную гликогенфосфорилазу В в активную форму гликогенфосфорилазу A, последняя отщепляет от гликогена остатки глюкозо-1-фосфата. Киназа фосфорилазы активируется протеинкиназой А.

Протеинкиназа А

Протеинкиназа А, или цАМФ-зависимая протеинкиназа, относится к семейству ферментов, активность которых зависит от уровня циклического АМФ в клетке. Протеинкиназа А является самой изученной из всех протеинкиназ, её функции разнообразны, она участвует в регуляции метаболизма гликогена, липидов и сахаров, её субстратами могут быть другие протеинкиназы или другие метаболические ферменты.

Протеинкиназа А участвует в цАМФ-стимулируемой транскрипции генов, которые имеют цАМФ-реактивный элемент в регуляторном участке. Повышение концентрации цАМФ ведет к активации протеинкиназы А, которая фосфорилирует транскрипционный фактор CREB по остатку серина 133, CREB связывает своим фосфорилированным участком коактиватор транскрипции и стимулирует транскрипцию.

Молекула протеинкиназы А является холоферментом и в неактивном состоянии является тетрамером — состоит из двух регуляторных и двух каталитических субъединиц. Если уровень цАМФ в клетке низкий, холофермент остается интактным и каталитическая активность отсутствует. Когда концентрация цАМФ в клетке возрастает, цАМФ связывается с двумя сайтами связывания на регуляторных субъединицах, происходят конформационные изменения, диссоциация тетрамера на два каталитически активных димера. Открытые активные центры каталитических субъединиц переносят концевой фосфат молекулы АТФ на остатки серина или треонина.

Протеинкиназы А представлены в многих типах клеток, и проявляют каталитические активности в отношении разных субстратов, поэтому, работа протеинкиназы А и концентрация цАМФ регулируется во многих биохимических путях. Следует отметить, что действие протеинкиназы А, вызванное фосфорилированием, как правило, кратковременное, так как протеинфосфатазы, сопряженные с протеинкиназами, быстро дефосфорилирует мишени.

Гормоны инсулин и глюкагон влияют на работу протеинкиназы А, изменяя уровень цАМФ в клетке по механизму активации рецепторов, связанных с G-белками, через аденилатциклазу. Инсулин активирует аденилатциклазу, повышая концентрацию цАМФ, протеинкиназа А фосфорилирует ферменты ацетил-КоА-карбоксилазу и пируватдегидрогеназу, направляя таким образом ацетил-КоА для синтеза липидов; глюкагон имеет противоположный эффект.

Работа протеинкиназы А регулируется и по механизму отрицательной обратной связи. Одним из субстратов, активируемых протеинкиназой А, является фосфодиэстераза, которая превращает цАМФ в АМФ, таким образом, снижая концентрацию цАМФ и ингибируя протеинкиназу А.

Протеинкиназа B

Геном человека содержит семейство генов Akt1, Akt2, Akt3. Протеинкиназа Akt1 ингибирует процессы апоптоза, принимает участие в регуляции клеточного цикла, индуцирует синтез белка и поэтому является ключевым белком, регулирующим рост тканей, а также отвечает за развитие мышечной гипертрофии. Поскольку продукт гена Akt1 блокирует апоптоз, повышенный уровень экспрессии Akt1 отмечается во многих опухолях. Первоначально Akt1 был охарактеризован как онкоген в трансформирующем ретровирусе AKT8 в 1990 году.

Продукт гена Akt2 является важной сигнальной молекулой в пути передачи сигнала молекулой инсулина, этот белок требуется для транспорта глюкозы.

Показано, что Akt3 преимущественно экспрессируется в мозге. Мыши, лишенные гена Akt3, имеют маленький мозг. Мыши, нокаутные по гену Akt1, но имеющие ген Akt2 имели меньший размер. Так как уровень глюкозы у таких мышей был в норме, была показана роль Akt1 в процессах роста.

Мыши, нокаутные по гену Akt2, но имеющие Akt1, имели задержки роста и фенотипические проявления инсулин-зависимого диабета. Полученные данные указывали на роль Akt2 в проведении сигнала от инсулинового рецептора.

Регуляция активности Akt осуществляется путем связывания фосфолипидов в мембране. Akt содержит PH-домен, который высокоаффинно связывает фосфатидилинозитол-трифосфат или фосфатидилинозитол-дифосфат. PH-домены выполняют функции заякоривания в мембранах. PIP2 может быть фосфорилирован только PIP3-киназами, и только в случае, когда клетка получила сигнал к росту. PIP3-киназы могут быть активированы рецепторами, связанными с G-белками или рецепторами с тирозинкиназной активностью. Только после активации PIP3-киназы фосфорилируют PIP2 в PIP3.

После связывания с PIP3 и закрепления в мембране Akt может быть активирована путем фосфорилирования фосфоинозитол-зависимыми киназами. PDK1 фосфорилирует Akt, mTORC2 стимулирует фосфорилирование PDK1. Активированная Akt далее регулирует фосфорилированием активность многих субстратов. Показано, что Akt может быть активирована и без участия PIP3-киназ.

Соединения, повышающие концентрацию цАМФ могут активировать Akt через протеинкиназу А. Фосфатазы липидов контролируют концентрацию PIP3, например, супрессор опухолей PTEN работает как фосфатаза, и дефосфорилирует PIP3 в PIP2. Akt диссоциирует от плазматической мембраны и активность фермента значительно падает. Протеинфосфатазы контролируют количество фосфорилированного Akt. Фосфатазы PHLPP дефосфорилируют серин 473 в Akt и тем самым инактивируют её.

Akt регулирует многие процессы, направленные на выживание клетки. Например, Akt может фосфорилировать про-апоптотический белок BAD по остатку серина 136, что вызывает диссоциацию BAD из Bcl-2/Bcl-X комплекса и приводит к утере про-апоптотической функции. Также Akt активирует транскрипционный фактор NF-κB, и включает транскрипцию генов выживания.

Akt требуется для инсулин-индуцируемой транслокации транспортера глюкозы 4 в плазматическую мембрану. Киназа-3 гликогенсинтетазы может быть ингибирована фосфорилированием Akt, что вызывает синтез гликогена.

Akt1 также связана с ростом сосудов и развитием опухолей. Недостаточность Akt1 у мышей ингибирует физиологический ангиогенез, но усиливает патологический рост сосудов и опухолей.

Протеинкиназа С

Протеинкиназы С — это семейство протеинкиназ, содержащее порядка десяти изоферментов, которые классифицируют по вторичным посредникам на три семейства: традиционные, или классические, оригинальные, или нестандартные и нетипичные. Традиционным протеинкиназам С для активации требуется Ca, диацилглицерол или фосфатидилхолин.

Оригинальные протеинкиназы С активируются молекулами диацилглицерола, и не требуют Ca. Традиционные и оригинальные протеинкиназы С активируются через сходные пути сигнальной трансдукции, например, с помощью фосфолипазы С. Нетипичные изоформы, не требуют ни Ca, ни диацилглицерола для активации.

Все протеинкиназы С состоят из регуляторного и каталитического доменов, связанных шарнирной областью. Каталитические районы высоко консервативны между разными изоформами, и значительно отличаются от каталитических районов других серин-треониновых протеинкиназ. Консервативность каталитических доменов связано с выполняемыми функциями, различия в регуляторных районах обуславливают различия во вторичных посредниках.

Регуляторный домен на N-конце протеинкиназы С содержит отдельные участки. С1 домен, представленный во всех изоформах протеинкиназы С, имеет сайт связывания диацилглицерола. С2 домен воспринимает ион Ca. Район псевдосвязывания субстрата представляет собой короткую последовательность аминокислот, которые подражают субстрату и занимают участок связывания субстрата в активном центре, делая фермент неактивным.

Ca и диацилглицерол связываются с доменами С2 и С1, соответственно, и вызывают прикрепление протеинкиназы С к плазматической мембране. Взаимодействие с мембраной вызывает освобождение псевдосубстрата из каталитического центра и активирует фермент. Для осуществления подобных аллостерических взаимодействий, протеинкиназе С требуется предварительное фосфорилирование каталитического района.

Протеинкиназа С должна быть предварительно фосфорилирована и для осуществления собственной киназной активности. Молекула протеинкиназы С содержит несколько сайтов фосфорилирования 3-фосфоинозитол-зависимой протеинкиназой-1. После активации протеинкиназа С переносится к плазматической мембране и присоединяются к RACK-белкам, аминокислотная последовательность которых на 47 % гомологична бета-субъединицам G-белков.

Для протеинкиназ С характерен длительный период активности, которая сохраняется, даже если первоначальный сигнал пропал или снизилась концентрация ионов Ca. Это достигается образованием диацилглицерола из фосфатидилхолина с помощью фосфолипазы С.

Последовательность остатков аминокислот в молекуле протеинкиназы С сходна с таковой для протеинкиназы А, и содержит остатки основных аминокислот вблизи остатков серина и треонина, подвергающихся фосфорилированию. Субстратами протеинкиназы С являются следующие белки: MAP-киназы, Raf-киназы, MARCKS. Белки-субстраты протеинкиназы С играют важную роль в поддержании формы клеток, способности к движению, секреции, трансмембранном транспорте, регуляции клеточного цикла. MARCKS вовлечены в процессы экзоцитоза некоторых секреторных пузырьков, содержащих, муцин и хромафин. MARCKS — кислые белки, содержат большое количество остатков аланина, глицина, пролина и глутаминовой кислоты. MARCKS связаны N-концом с липидами мембраны, регулируются ионами Ca, кальмодулином, протеинкиназой С.

VDR — кальцитриоловый рецептор. Рецептор стероидных гормонов из семейства ядерных рецепторов. После активирования молекулой витамина D, образует гетеродимер с ретиноидным-Х-рецептором и связывается с регуляторными элементами на ДНК, изменяя экспрессию генов или снимая репрессоры генов. Глюкокортикоиды снижают экспрессию VDR во всех тканях.

Рецептор эпидермального фактора роста — относится к семейству рецепторов факторов роста, связывающих внеклеточные белковые лиганды и обладает тирозинкиназными активностями. Мутации, затрагивающие EGRF часто могут проявляться в раковом перерождении клетки. После связывания лиганда, рецептор димеризуется, происходит самофосфорилирование по пяти остаткам тирозина на С-конце рецептора, и EGRF приобретает внутриклеточную тирозинкиназную активность.

Последующая активность EGRF связана с инициацией каскада сигнальной трансдукции, активируются MAPK, Akt, JNK — что приводит к синтезу ДНК и пролиферации. Киназный домен также может фосфорилировать другие рецепторы, связанные с EGRF по остаткам тирозина.

Ca/кальмодулин — зависимые протеинкиназы

Ca2+/кальмодулин-зависимая киназа II

Са/кальмодулин-зависимые киназы, или СаМ киназы, регулируются Са/кальмодулиновым комплексом. СаМ киназы классифицируют на два класса: специализированные СаМ киназы и многофункциональные СаМ киназы, порядка 2 % белков головного мозга представлены СаМ второго типа.

Кальмодулин — это вездесущий, кальций-связывающий белок, который связывается с многими другими белками и регулирует их активность. Это маленький кислый белок, состоит из 148 аминокислотных остатков, содержит четыре домена связывания кальция.

СаМ служит промежуточным звеном в воспалении, апоптозе, мышечных сокращениях, развитии кратковременной и длительной памяти, росте нервов и иммунном ответе. Кальмодулин экспрессируется во многих типах клеток и находится в цитоплазме, внутри органелл, а также находится в плазматической мембране и мембранах органелл. Многие белки, которые связываются с кальмодулином, не могут сами связывать кальций и используют кальмодулин как «датчик» кальция и компонент системы передачи сигнала.

Кальмодулин

Кальмодулин также используется для запасания Ca в эндоплазматическом и саркоплазматическом ретикулумах. После связывания кальция молекула кальмодулина претерпевает конформационные изменения, что позволяет молекуле связывать другие белки для осуществления специфического ответа. Молекула кальмодулина может связать до четырёх ионов кальция, может подвергаться посттрансляционной модификации, например, фосфорилированию, ацетилированию, метилированию, протеолизу, причем эти модификации могут модулировать активность СаМ.

Киназа легких цепей миозина. Киназа легких цепей миозина фосфорилирует миозин. Киназа легких цепей миозина имеет ключевое значение в сокращении гладкой мускулатуры. Сокращение гладких мышц может произойти после повышения концентрации кальция в результате притока из саркоплазматического ретикулюма или из внеклеточного пространства. Сперва кальций связывается с кальмодулином, это связывание активирует киназу легких цепей миозина, которая фосфорилирует легкие цепи молекул миозина. Фосфорилирование позволяет молекулам миозина образовывать поперечные мостики и связываться с актиновыми филаментами и стимулирует мышечное сокращение. Данный путь является основным в механизме сокращения гладких мышц, так как гладкие мышцы не содержат тропонинового комплекса, в отличие от поперечно-полосатых.

МАРK

Митоген-активируемые киназы отвечают на внеклеточные стимулы и регулируют многие клеточные процессы. МАРК вовлечены в работу многих неядерных белков — продуктов онкогенов. Внеклеточные стимулы ведут к активации МАРК через сигнальный каскад, который состоит из МАРК, МАРКК и МАРККК. МАР3К активируется внеклеточными стимулами и фосфорилирует МАР2К, затем МАР2К фосфорилированием активирует МАРК. Такой сигнальный МАР-каскад консервативен для эукариот от дрожжей до млекопитающих.

MAP/ERK система передачи сигнала

MAPK/ERK-киназы принимают участие в особом пути сигнальной трансдукции. ERK — или классические МАР-киназы, регулируются внеклеточными сигналами.

Рецепторы, связанные с тирозиновыми киназами, активируются внеклеточными лигандами. Связывание EGF с рецептором приводит к фосфорилированию EGFR. Белок GRB2, содержащий SH2-домен, связывается с остатками фосфорилированного тирозина. Белок GRB2 своим SH3-доменом связывается и активирует SOS. Активированный гуанин-нуклеотид заменяющий фактор отщепляет ГДФ от белка Ras, Ras далее может связать ГТФ и активироваться.

Активный Ras активирует RAF-киназу. RAF-киназа фосфорилирует и активирует МЕК, другую серин-треониновую киназу. МЕК фосфорилирует и активирует МАРК. Эта серия киназ от RAF к МЕК и к МАРК является примером каскада протеинкиназ.

Один из эффектов активации МАРК это изменение трансляции мРНК. МАРК фосфорилирует и активирует S6 киназу 40S рибосомных белков. RSK фосфорилирует рибосомный белок S6, и вызывает его диссоциацию от рибосомы.

МАРК регулирует активности нескольких транскрипционных факторов, например, C-myc. МАРК регулирует активность генов, контролирующих клеточный цикл.

* * *

цГМФ является вторичным мессенджером, участвующим в различных процессах внутриклеточной сигнализации, и опосредующим эффект широкого ряда гормонов, нейромедиаторов, лекарственных средств и токсинов. В последние годы выявлена важная роль цГМФ в регуляции процессов Са²⁺-сигнализации и Са²⁺-гомеостаза в различных типах клеток. Представлялось целесообразным исследовать возможное участие гуанилатциклазной системы в регуляции Са²⁺-сигналов в перитонеальных макрофагах при их стимуляции АТФ, УТФ, тапсигаргином или циклопьязониковой кислотой (ЦПК). Мы использовали агенты, повышающие внутриклеточную концентрацию цГМФ: нитроглицерин и нитропруссид Na. Эти нитросоединения стимулируют образование эндогенной окиси азота (NO), которая активирует цитозольные формы гуанилатциклазы. С использованием флуоресцентного Са²⁺-зонда Fura-2 показано, что нитроглицерин и нитропруссид Na существенно уменьшают фазу мобилизации Са²⁺ из депо и практически полностью подавляют вход Са²⁺, индуцированный АТФ или УТФ. В перитонеальных макрофагах АТФ и УТФ связываются с пуринорецепторами P_2u типа, активирующими фосфолипазу С. Для рецепторов, связанных с G_q-белками и активирующих гидролиз фосфоинозитидов, показана отрицательная модуляция NO, приводящая к уменьшению продукции IР₃ и диацилглицерола и в результате к ингибированию мобилизации Са²⁺ из депо. Отрицательная модуляция гидролиза фосфоинозитидов NO предотвращает чрезмерную мобилизацию Са²⁺ из депо. Прединкубация макрофагов с нитроглицерином или нитропруссидом Na существенно ускоряет спад Ca²⁺-сигналов. вызванных АТФ или УТФ, по сравнению с контролем. Ускорение спада Са²⁺-ответов может быть связано с активацией Са²⁺-АТФаз в плазматической мембране и в мембране внутриклеточных депо. Нитроглицерин и нитропруссид Na также значительно подавляют обе фазы Са²⁺-сигналов, вызванных тапсигаргином или ЦПК. Увеличение внутриклеточной концентрации цГМФ приводит к подавлению депо-зависимого входа Ca²⁺ в макрофаги, вызванного тапсигаргином или ЦПК. Нитропруссид Na значительно быстрее и эффективнее подавляет депо-зависимый вход Са²⁺, вызванный ингибиторами эндоплазматических Са²⁺-АТФаз, чем вход Са²⁺, индуцированный пуринергическими агонистами. Известно, что в тромбоцитах человека соединения, повышающие концентрацию цГМФ, не влияют на вход Са²⁺ по АДФ-активируемым Са²⁺-каналам. Можно предположить, что и в макрофагах активируемый АТФ вход Са²⁺ по каналам Р_2z рецепторов менее чувствителен к действию нитропруссида, чем депо-зависимый вход Са²⁺. Полученные данные свидетельствуют о том, что концентрация цГМФ играет важную роль в регуляции Са²⁺-гомеостаза в перитонеальных макрофагах крысы.

* * *

2.7.МО-синтетаза. Механизм образования окиси азота в кардиомиоцитах и гладкомышечных клетках.

Моноамин-синтетаза (NOS)

NO-синтазы: общие сведения

Обратные ссылки

Синтез NO осуществляется семейством цитохром- P-450-подобных гемопротеинов - NO-синтаз . Молекулы NO-синтаз содержат домены с редуктазной и оксигеназной активностью. Полное систематическое название этого фермента: L-аргинин, NADPH: кислород оксидоредуктаза [ E.C. 1. 14. 13. 39 ] [ Nathan ea 1994 ].

В каталитически активной форме NO-синтаза состоит из двух идентичных субъединиц (молекулярная масса 130-150 кДа), каждая из которых связана с молекулой СаМ . NO-синтаза имеет редкую для эукариотических ферментов структуру флавогемопротеина .

Каждая субъединица содержит 4 простетических гpynnы: гем ( железопротопорфирин IX ), флавинмононуклеотид ( FMN ), флавиндинуклеотид ( FDN ) и тетрагиробиоптерин , а также участок связывания СаМ [ Marletta ea 1994 , Nathan ea 1994 ].

В NO-синтазе соединена активность двух отдельных ферментов: оксидазная - подобно содержащему гем цитохрому Р-450 и редуктазная - подобная флавинсодержащей редуктазе этого цитохрома. Между этими ферментами и NO-синтазой имеется не только функциональная, но и структурная гомология . Так, первичная структура С-концевой области NO-синтазы на 53% гомологична редуктазе цитохрома Р-450 [ Marletta ea 1994 , Nathan ea 1994 ]. N-концевая область содержит консервативные домены, связывающие гем и домены, связывающие СаМ [ Nathan ea 1994 ]. Спектральные характеристики гемовых групп NO-синтазы такие же, как у цитохромов Р-450 [ Marletta ea 1994 ].

По характеру индукции и действия ферменты разделяются на два вида:

1) Наиболее активная кальций-независимая, индуцибельная ( цитокинами ) NO-синтаза индуцибельная (II тип) .

2) NO-синтазы (I и III тип) конститутивные - менее активные, кальций-кальмодулин-зависимые ферменты.

Спектр катализируемых NO-синтазами реакций также во многом схож ( табл. 4 ). Альтернативными субстратами- ингибиторами синтеза оксида азота для них являются N-производные аргинина ( рис. 2 ). Кроме того, в качестве ингибиторов NO-синтаз могут выступать соединения, связывающиеся с гемовой частью ферментов (имидазольные производные), ингибирующие связывание и биосинтез тетрагидробиоптерина, антагонисты кальмодулина ( трифторпиразин , хлорпромазин , кальмидазолин , W7 , W13 ) [ Loesch, ea 1993 ].

Конститутивные NO-синтазы , выделяемые из клеток разных типов, во многом сходны между собой, но сильно отличаются от индуцибельных изоферментов. Антисыворотка против NO-синтазы головного мозга взаимодействует с конститутивно экспрессируемыми ферментами из других клеток, в частности эндотелиоцитов, но не реагирует с индуцибельной NO-синтазой, что указывает на их принципиальное различие [ Ljesch, ea 1993 ].

Кроме того, показано, что ингибиторы NO-синтазы обладают разной эффективностью в отношении разных изоферментов: так, N-нитро-Ь-аргинин в 300 раз более интенсивно ингибирует NO-синтазу мозга быка, чем NO-синтазу мышиных макрофагов [ Furfine, ea 1993 ]. Глюкокортикоиды супрессируют индуцибельную NO-синтазу , но не влияют на активность конститутивных изоферментов [ Forstermann, ea 1994 ].

///Группы амино­кислот:

Незаменимые: изолсйцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, -3-триптофан, валин.

Условнонезаменимые: аргинин, гистидин, цистин, тирозин.

Заменимые: аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глутамин, глицин, глутаминовая кислота.

Все природные аминокислоты являются аль­фа-аминокислотами L-ряда. Они лучше усваиваются организмом, чем аминокислоты D-ряда. Исключение составляет фенилаланин, ко­торый может иметь формулу DL-фенилаланина.

из L-аргинина синтезируется фермент (синтетаза мо­ноокиси азота) и внутриклеточно образуется мо­ноксид азота (NО)- нестойкое соединение, ко­торое существует в организме около 2-часов.///

Под воздействием цитокинов и бактериальных эндотоксинов в целом ряде клеток и тканей происходит активация кальций-независимой индуцируемой МО-синтетазы (NOS). Индуцируемая NOS может синтезировать избыточное количество NO в течение длительного времени, вызывая выраженную вазодилатацию, обусловленную активацией гуанилатциклазы и образованием циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ).

Синтазы оксида азота, NO-синтазы (англ. NO-synthase, NOS) — группа ферментов, катализирующих образование оксида азота и цитруллина из аргинина, кислорода и NADPH.

Оксид азота играет важную роль в организме млекопитающих, он вырабатывается фагоцитами в процессе борьбы с бактериями, но также участвует и в нейротрансмиссии, регулировке кровообращения, других аспектах функионирования разных органов и тканей.

В настоящее время рассматривается возможное участие генов, кодирующих синтез оксида азота в развитии патологии легких при муковисцидозе