4.4. Мутанты, резистентные к воздействию

по принципу обратной связи

Самым легким путем выделения мутантов, резистентных к ингибированию или подавлению по принципу обратной связи, служит отбор по показателю устойчивости к токсическим аналогам целевых соединений.

Механизм отбора может быть объяснен на примере мутанта для повышенного продуцирования аминокислоты. Аминокислота А обычно ингибирует и подавляет собственные биосинтетические ферменты и входит также в состав белка. В то время как подавляющее большинство клеток, экспонированных к А, отмирает по причине голодания в отношении А, мутанты, нечувствительные к А, могут оставаться способными производить А и расти в виде колоний.

Благодаря указанным явлениям эти мутанты обладают повышенной продуктивностью по А. В табл. 4.1 перечислены аналоги, которые были применены для селекции мутантов c повышенным выходом в отношении аминокислот, пуринов и витаминов.

Хорошим примером использования данного метода является разработка биохимического синтеза треонина – аминокислоты, незаменимой для полноценного питания людей и животных. Процесс осуществляют с помощью мутанта Brevibacterum flavum, который способен продуцировать L-треонин в количестве 14 г/л.

Таблица 4.1

Примеры аналогов для селекции мутантов, способных к повышенной продуцируемости метаболитов

Аккумулируемый продукт

Аналоги для селекции

Фенилаланин Тирозин Триптофан Гистидин Пролин Валин Изолейцин Лейцин Треонин Метионин Аргинин Аденин Урацил Гипоксантинн, инозин Гуанозин Никотиновая кислота Пиридоксин n-аминобензойная кислота Тиамин

n-фторфенилаланин; тиенилаланин D-тирозин 5-метилтриптофан; 6-метилтриптофан; 5-фтортриптофан 2-тиазолаланин; 1,2,4-триазол-3-аланин 3,4-дегидрополин α-аминомасляная кислота Валин; изолейцингидроксамат; α-амино-масляная кислота; α-амино-β-гидрокси-валериановая кислота; O-метилтреонин Трифторлейцин; 4-азалейцин α-амино-β-гидроксивалериановая кислота Этионин; норлейцин; α-метилметионин; L-метионин-D,L-сульфоксимин Канаванин; аргинингидроксамат, D-аргинин 2,6-диаминопурин 5-фторурацил 5-фторурацил, 8-азагуанин 8-азаксантин 3-ацетилпиридин Изониазид Сульфонамид Пиритиамин

Мутации в направлении достижения резистентности к ингибированию и подавлению по принципу обратной связи, будучи объединенными в одном штамме, часто имеют результатом синергизм в отношении продуктивности. Практическим приложением является попытка увеличить содержание метионина в дрожжевых клетках. Эта попытка предпринята, поскольку содержание незаменимой аминокислоты метионина в дрожжевом белке чрезвычайно низкое. Микроб Candida petrophilum был мутирован в направлении придания ему резистентности к метионину. В результате внутриклеточная концентрация свободного метионина в пуле аминокислот увеличилась. Это привело к повышению на 40 % полного содержания его в клетке (с 9 до 13 мг/г по СВ клеток).

Если культура по своей природе резистентна к аналогам, ее можно превратить в чувствительную к этим факторам культуру посредством изменения питательной среды. Так, культура Pseudomonas aeruginosa при выращивании на глюкозе резистентна ко многим аналогам, но становится чувствительной к ним при выращивании на фруктозе.

Отсутствие ферментов, чувствительных к воздействию конечных продуктов по принципу обратной связи, вследствие восстановления их с помощью вторичных мутаций, часто приводит к возникновению ревертантов, которые выделяют важные конечные продукты. В результате получают ферменты с измененной последовательностью чередования аминокислот, которые, пусть и сохраняют каталитическую активность, однако не связывают уже ингибитор, работающий по принципу обратной связи.