7. Факторы, влияющие на биосинтез ферментов в процессе культивирования
На процесс биосинтеза ферментов оказывают существенное влияние уровень питательных веществ и их сбалансированность, отвод метаболитов, изменение кислотности среды и температуры, насыщенность среды растворенным кислородом, а также некоторые другие факторы (например, возраст и состояние культуры продуцента).
Влажность питательной среды
Влажность среды при выращивании ферментов на твердых сыпучих средах имеет большое значение; так, при влажности среды от 11 до 20 % развитие микроорганизмов почти невозможно.
Обычно рост начинается при влажности свыше 30 %. Влажность 40–45 % считается неблагоприятной и способствует обильному спорообразованию культуры (рис. 7.1, кривая 1). Оптимальная влажность среды зависит от вида продуцента, физического состояния среды при данной влажности и способа обработки. Так, высокая влажность способствует слипанию частиц среды, нарушению рыхлости и ухудшению условий роста культуры.
Рис. 7.1. Влияние влажности твердой питательной среды на спорообразование (1) и накопление ферментов при поверхностном культивировании (2), проведении процесса
в автоматизированных установках (3) и выращивании в открытых емкостях (4)
Рис. 7.2. Изменение влажности среды (1, 2) и биосинтеза
амилолитических ферментов (3, 4) в процессе роста культуры.
1, 2 – влажность; 3, 4 – амилолитическая активность; 1, 3 – выращивание в открытых кюветах; 2, 4 – выращивание в колбах под ватными пробками в термостате.
При поверхностном культивировании (рис. 7.1, кривая 2) по мере роста культуры происходит заметное уменьшение содержания сухих веществ, которые превращаются в СO2 и Н2O. Если культивирование ведется в закрытых емкостях (рис. 7.1, кривая 3), например, в колбах под ватными пробками или в закрытых специализированных кюветах, где испарение влаги ограничено, то при росте культуры наблюдается некоторое увеличение влажности (см. также рис. 7.2).
Если культура выращивается в открытых емкостях при интенсивном аэрировании, наблюдается ее подсушивание, которое при влажности W < 50 % может повлечь за собой уменьшение продуцирующей способности культуры и снижение активности в продукте (рис. 7.1, кривая 4).
Оптимальная влажность культуры и ее уровень во многом зависят от физиологических особенностей продуцента и от способа выращивания культуры (рис. 7.2).
Аэрирование растущей культуры
Степень аэрирования определяется способом культивирования и физиологией микроорганизмов – продуцентов ферментов. Аэрирование растущей культуры преследует следующие цели: снабжение микроорганизма кислородом, необходимым для его роста и развития; удаление с отходящим воздухом газообразных продуктов обмена; частичное снятие и отвод тепла, выделяемого микроорганизмом в процессе роста.
Большое значение придается вопросу отвода воздухом тепла. В связи с этим необходимо рассмотреть фазы роста микроскопических грибов, поскольку именно эту группу микроорганизмов в основном используют при поверхностном способе культивирования [5].
Первая фаза – набухание спор и их прорастание; длительность фазы составляет 10–12 ч. Эта стадия не сопровождается заметным тепловыделением, поэтому аэрирование культуры умеренное (4–5 объемов воздуха на объем камеры в час) при относительной влажности воздуха 95–96 % и оптимальной температуре.
Вторая фаза – стадия роста; она продолжается 12–40 ч и сопровождается интенсивным потреблением питательных веществ из среды, выделением тепла, углекислоты и воды. В это время микроорганизм нуждается в интенсивном аэрировании для удаления газообразных продуктов метаболизма и отвода выделяющегося тепла. Температурный режим в камере следует соблюдать строго и относительную влажность воздуха поддерживать около 100 %, иначе можно преждевременно подсушить культуру, и накопление ферментов в культуре приостановится (рис. 7.2). Чем интенсивнее аэрирование, тем глубже идут окислительные процессы, тем больше потребляется сухого вещества среды на дыхание и тем меньше выход готовой культуры. Процесс окисления органических веществ сопровождается значительным выделением теплоты – до 3000–4000 кДж/кг культуры (75–80 % от всего выделяемого тепла); при этом потребляется до 25–30 % сухого вещества.
Для расчета необходимого воздухообмена строят график тепловыделения за все время выращивания микроорганизма. В зависимости от состава среды и вида микроорганизма кривые тепловыделения будут различны (рис. 7.3). При культивировании микроорганизмов на пшеничных отрубях, содержащих 16–25 % крахмала (кривые 1 и 2), удельное тепловыделение достигает 340–435 кДж/(кг∙ч), а на среде, состоящей преимущественно из шелухи крупяных культур, содержащих в 3 раза меньше крахмала (кривая 3), удельное тепловыделение составляет лишь 125 кДж/(кг∙ч).
Воздух, подаваемый в камеру для активного роста культуры, имеет температуру на 2–3 °C ниже, чем в период ее прорастания.
Средняя физиологическая потребность в кислороде в фазе активного роста составляет ≈ 7,6 м3 на 1 т культуральной жидкости (КЖ) в час.
Рис. 7.3. Удельное тепловыделение в процессе поверхностного культивирования культур:
1 – A. oryzae; 2 – А. awamori; 3 – Triehothecium roseum
Третья фаза (идиофаза) соответствует биохимической и морфологической специализации культуры, когда наблюдаются накопление вторичных метаболитов. Это период интенсивного образования микроорганизмами внеклеточных ферментов.
При этом рекомендуется снизить температуру в растительных камрах на 3–4 °C и уменьшить воздухообмен в 3–5 раз по сравнению с периодом интенсивного роста. Когда накопление ферментов в культуре достигает максимума, в камеру подают сухой воздух, подогретый до 38–40 °C. Культура за 2–3 ч подсыхает на 10–15 %, что облегчает впоследствии ее отделение от перфорированной поверхности кюветы.
Таким образом, аэрирование глубинной культуры является весьма важным фактором; интенсивность аэрирования неодинаково влияет на продуцирующую способность различных микроорганизмов [5], что наглядно видно из сравнения данных, представленных на рис. 7.4, 7.5.
Рис. 7.4. Биосинтез глюкозоизомеразы S. Albogriseolus 20-3: 1, 2, 3 – изменение pH среды; 1’, 2’, 3’ – глюкозоизомеразная активность; 1’’, 2’’, 3’’ – накопление биомассы
Рис. 7.5. Биосинтез ферментов микроорганизмами B. mesentericus:
1 – α-амилазная активность; 2 – протеолитическая активность; 3 – целлюлазная активность
Увеличение степени аэрирования среды обеспечивает интенсификацию процесса биосинтеза ферментов и в большинстве случаев – сокращение длительности культивирования (рис. 7.6).
Рис. 7.6. Влияние аэрирования на длительность культивирования Endomycopsis sp.20-9 и биосинтез глюкоамилазы: 1 – выращивание на круговой качалке; 2, 3, 4 – выращивание
в ферментаторе при степени аэрирования 30 л/(л·ч) (2), 50 л/(л·ч) (3) и 60 л/(л·ч) (4).
Скорость роста тех или иных штаммов неодинакова. Она зависит не только от состава среды, но и от способа ее подачи при культивировании (рис. 7.7, 7.8), степени аэрирования (рис. 7.6), от того, является фермент внеклеточным или внутриклеточным, и изменяется по ходу культивирования, как это показано на рис. 7.8.
Следует знать, что pH среды при поверхностном культивировании, в силу высокой буферности и малой влажности среды, оказывает гораздо меньшее влияние на процесс образования ферментов, чем при осуществлении схемы глубинного культивирования.
Рис. 7.7. Влияние состава среды и дробного ее введения
на биосинтез β-глюканазы и накопление биомассы по ходу культивирования:
1, 1’ – содержание биомассы (Б); 2, 2’ – β-глюканазная активность, ед./мл (ГлА); 3, 3’ – содержание редуцирующих веществ (РВ)
Рис. 7.8. Влияние состава среды и длительности культивирования
на биосинтез липазы Rhizopus microsporus:
1 – водный экстракт хлопкового шрота; 2 – кукурузный экстракт; 3 – молочная сыворотка
Так, при поверхностном культивировании для увлажнения твердой среды используется водопроводная вода; pH увлажненной среды в этом случае составляет 5,0–5,6. Если же отруби увлажняют слабыми растворами соляной, серной или молочной кислоты, pH среды будет несколько меньше (снизится до 4,5–5,0). Добавление указанных кислот способствует созданию селективных условий развития микроскопических грибов, что позволяет снизить требования к стерилизации среды и воздуха.
При глубинном же культивировании большое значение имеет не только исходная величина рН, но и изменение водородного показателя в результате потребления катионов или анионов в процессе жизнедеятельности
Рис. 7.9. Влияние pH среды на ферментсинтезирующую способность микроорганизмов:
1 – внутриклеточная глюкоизомеразная активность; 2 – биомасса;
3 – глюкоамилазная активность; 4 – мальтазная (гликозилтрансферазная) активность
микроорганизма и стерилизации среды. В зависимости от типа потребляемых ионов может происходить как подщелачивание, так и подкисление КЖ. Кроме того, известно, что грибы и дрожжеподобные организмы хорошо растут и образуют ферменты в средах, имеющих pH от 3,8 до 5,6. При изменении состава продуктов метаболизма водородный показатель тоже может смещаться как в кислую, так и в щелочную область.
В целом, справедливо говорить, что большая часть микроорганизмов чувствительна к уровню pH среды. Из рис. 7.9 хорошо видно, что отклонение от оптимального значения снижает способности микроорганизмов к образованию ферментов.
Температура культивирования
Продуценты ферментов, особенно микроскопические грибы, являются мезофильными микроорганизмами. Оптимальная температура их развития равна 22–32 °C (рис. 7.10).
В то же время среди бактериальных продуцентов ферментов имеются термофильные микроорганизмы, для которых подходящая температура культивирования составляет 35–55 °C. Они представляют большой интерес для промышленного использования, так как культивирование при высоких температурах позволяет снизить требования к стерильности процесса. Кроме того, термофильные микроорганизмы синтезируют ферменты, обладающие повышенной термостойкостью.
В целом температура оказывает существенное влияние на скорость накопления ферментов. Последняя нарастает с повышением температуры культивирования (если микроорганизм термостабилен); при этом можно иногда ожидать, что суммарное количество синтезируемого фермента также увеличится.
Рис. 7.10. Биосинтез глюкозоизомеразы при различной температуре: 1 – 29 ºС; 2 – 32 ºС;
3 – 35 ºС; 1', 2', 3' – изменение рН среды при соответствующей температуре