5.5. Регуляция по принципу обратной связи
Во вторичном метаболизме определенную роль играет регуляция по принципу обратной связи. Например, хлорамфеникол ингибирует свой собственный биосинтез. Это же свойство присуще, например, пенициллину, ристомицину и вирджиниамицину.
Рис. 5.2. Ингибирование L-лизином C-L-валина, включаемого в пенициллин у Penicillium chrysogenum: 1 – контроль; 2 – L-лизин
Рис. 5.3. Разветвленная цепь метаболических превращений, ведущих к образованию лизина и пенициллина у Penicillium chrysogenum
Биосинтез пенициллина микроорганизмом Penicillium chrysogenum подвергается ингибированию по принципу обратной связи со стороны L-лизина (рис. 5.2). Причину такого эффекта можно установить, если детально рассмотреть разветвленный процесс, представленный на рис. 5.3.
Один из промежуточных продуктов биосинтеза лизина, а именно α-амино-адипат, также вовлекается в биосинтез пенициллина. По принципу обратной связи, ингибирование лизином первого фермента его собственного биосинтеза ограничивает продуцирование α-аминоадипата и косвенным путем ингибирует биосинтез пенициллина. Следовательно, если в процессе ферментации пенициллина добавляется α-аминоадипат, ингибирующее влияние лизина нейтрализуется. Другой способ, с помощью которого регуляция по принципу обратной связи контролирует образование вторичных метаболитов, заключается в ингибировании фосфатаз фосфатами. Многие ферментации ингибируются такими концентрациями фосфата, которые для роста не являются ингибирующими. Схема биосинтеза должна включать действие фосфатазы.
5.6. Контроль вторичного метаболизма
методом байпассирования
Многие методы метаболического контроля и регулирования основаны на принципе байпассирования или изменения состава среды, в которой проводят те или иные процессы.
Именно поэтому в процессе алкалоидных ферментаций добавляют индуктор триптофан; ограничивают количество фосфатов при получении стрептомицина во избежание ингибирования, по принципу обратной связи, вовлекаемых в биосинтез фосфатаз. Такие быстро метаболизируемые сахара, как глюкоза, вообще устраняют из среды или, при получении, например, пенициллина, медленно вводят в реакционную среду во избежание подавления биосинтетических механизмов. При этом важнейшеее влияние на продуцирование вторичных метаболитов оказывают мутации.
В отношении вторичного метаболизма мутации были использованы для того, чтобы получить высокоэффективные продуценты хлортетрациклина. Организм подвергали мутации до состояния, при котором способность к продуцированию антибиотика вообще исчезла, после чего организм возвращали в состояние активного продуцирования.
Когда вторичный метаболит сам является ингибитором роста продуцента (это имеет место при получении антибиотиков), для селекции резистентных культур с повышенной продуктивностью может быть использован сам антибиотик [5].
6. Обеспечение оптимального роста и продуцирование ферментов
6.1. Первичные факторы, которые необходимо учитывать
при осуществлении процесса ферментации
Основная причина интереса, проявляемого к микроорганизмам – потенциальным источникам ферментов, состоит в легкости, с которой уровни накопления ферментов в клетках могут быть повышены путем генетических манипуляций и подбора питательной среды. Чем выше удельная активность ферментов, тем проще добиться их выделения. Причины использования микробных клеток в качестве источников ферментов таковы:
– ферментации, если они проводятся в аппаратуре большой емкости, являются экономичными благодаря коротким циклам и дешевым питательным средам;
– легкость осуществления процессов фракционирования, и при этом культуры можно исследовать за короткий промежуток времени;
– различные виды микроорганизмов продуцируют неодинаковые ферменты, катализирующие определенные реакции, что позволяет им быстро приспособиться к условиям процессов.
При разработке метода и режима производства ферментов важно начать с правильного выбора наиболее активного штамма. Штаммы, продуцирующие тот или иной фермент, могут быть приобретены в других лабораториях, работающих в аналогичной области, либо их берут из музейных коллекций. При отсутствии необходимых микробных культур следует разработать программу их выделения из природных источников. Основным требованием к отбору является простота осуществления процедур, что обеспечивает испытание большого количества штаммов за относительно короткое время.
Если получен хороший штамм, то для того, чтобы вывести на максимальный уровень его рост, необходимо оптимизировать параметры ферментационного процесса. Важно правильно учесть влияние температуры, pH и подачи кислорода. Необходимо также правильно выбрать питание микроорганизма, особенно в отношении источников углерода, азота, фосфора, серы и минеральных солей. Часто, особенно в случае внеклеточных ферментов, большое значение имеет добавление в среду поверхностно-активных агентов. Обычно неионогенные поверхностно-активные вещества предпочитают анионным и катионным агентам, являющимся во многих случаях токсичными для микроорганизмов.
При проведении ферментации должна быть установлена стадия ростового цикла, для которой характерно наивысшее содержание накопившегося фермента. Во многих случаях ферменты, достигающие максимальной активности, быстро исчезают из ферментационной системы. С другой стороны, для получения ферментов пригоден хемостат, так как образование многих ферментов регулируется скоростью роста микроорганизмов, которая в непрерывной культуре может поддерживаться постоянной.
В дополнение к указанным факторам чрезвычайно важно использовать генетическую регуляцию процессов биосинтеза ферментов.