2.2.6 Исследование внутриклеточной лакказной активности грибов

Исследование проводили в супернатанте, который получали путем растирания биомассы мицелия глубинной культуры(1,0 г влажной биомассы, отмытый дважды водой) в 2 мл ацетатного буфера 0,1 М рН 4,4 с кварцевым песком в течение 5 минут. В полученную биомассу добавляли 0,1 М ацетатного буфера рН 4,4, растираем, гомогенат центрифугируем при 4000об./мин в течение 30 мин. Супернатант использовали для определения лакказной активности спектрометрическим методом [2].

2.2.7 Исследование влияния индукторов на лакказную активности исследуемых грибов

Грибы выращивали на питательной жидкой среде, осуществляя посев блочками агаризованного мицелия (1х1 см) по 1 на колбу с 50 мл среды.

В часть вариантов вносили сразу индукторы при посеве грибов, в другую часть – на 3-4 сутки роста. Контролем служили варианты грибных ферментных препаратов (КЖ или мицелий) без добавления индукторов.

В качестве индукторов использовали:

• Неорганические ионы: медь серноркислую, марганец хлористый, аммоний молибденовкислый в концентрациях 0,1―2 мМ

• органические кислоты: бензойную, щавелевую, лимонную, аскорбиновую в концентрациях в концентрациях 0,1―2 мМ,

• спирты: этиловый спирт, глицерин, эпихлоргидрин, оооооо в концентрациях 0,1-2 мМ

• лигноцеллюлозные материалы: древесные опилки (березово-осиновые), солома злаковых в концентрациях 1―2%

• синтетические красители: ремазол, п-нитрофенол, хризоидин, диметиламиноазобензол, азур 2, пара-нитрофенол, бензидин основание, активный ярко- голубой, хромовый темно-синий, судан III, фуксин основной, сафранин, кальцион, лакмоид, эрихром черный, нейтральрот, бриллиантовый синий, гемотоксилин, эозин БА, легкосмываемый красный, метилтиоловый синий, бромкрезолпурпур также был использован в качестве субстратов действия лакказ или индукторов в концентрациях 0,1 -2 мМ

В результате анализировали лакказную активность в КЖ и мицелии гриба на теку

щий момент роста грибов на средах с индукторами делали вывод о влиянии дан

ного индуктора.

2.2.8 Исследование влияния субстратов на лакказную активность

исследуемых грибов

Для исследования влияния субстрата (косубстрата) на лакказную активность исследуемых грибов использовали модифицированные питательные среды Чапека, Королевой-Скоробогатько, в которых глюкозу (сахарозу) заменяли полностью или частично на глицерин или на лигноцеллюлозу (опилки, солому или лузгу подсолнечника).

По ходу культивирования анализировали лакказную активность в КЖ и мицелии гриба на текущий момент роста грибов.

2.2.9 Определение кислотоводорастворимого лигнина в гидролизатах

лигноцеллюлозы по методу Класона

Анализ концентрации кислотоводорастворимого лигнина (КВЛ) проводили в пробах гидролизатов лигноцеллюлозы, полученных в результате культивирования мицелиальных грибов К-2, Х-1, К-21, В-1, П-1 и без грибов (контроль). В результате сравнения содержания КВЛ в образцах грибов и контроля делали вывод о деструкции лигноцеллюлозного материала КВЛ.

Определение содержания КВЛ в гидролизатах проводили спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм. Для удаления мешающего влияния белков использовали осаждение их с помощью 20% раствора ТХУ (к 3-5 мл пробы приливали 0,5-1,0 мл раствора ТХУ).