2. Материалы и методы исследования

2.1.1 Объекты исследования

Объектом исследования служили мицелиальные грибы, выделенные из почвенных и растительных проб республики Башкортостан с рабочим наименованием: П-1, В-1, К-2, К-21, Л-4, Л-4В, Х-1, Гр-1, Б-1 – продуценты лакказ.

2.2.1 Материалы исследования

В качестве материалов исследования использованы главным образом субстраты действия лакказ или их индукторы, а также минеральные соли в составе питательных сред.

К субстратам действия лакказ относятся изученные нами соединения: пирокатехин, ремазол, резорцин, 2,4 - диметилфенол, 2,6 - диметилфенол, гидрохинон, этанол, гваякол, К субстратам природного происхождения относятся лигноцеллюлозные материалы: древесные опилки (березово-осиновые), солома злаковых, шелуха прессованная подсолнечника обезжиренная (шрот), ряд синтетических красителей: эозин, активный голубой, азур II, п - нитрофенол.

Таблица 1 – Свойства субстратов и индукторов лакказ

Тривиальное название	Название по заместительной группе	Структурная формула	Растворимость в %		Молек. вес		ОДХ
			В воде	В др. раств-лях
Пирокатехин	1,2-диокси-бензол		легкорастворимый	―	110		410
Продолжение таблицы 1
Гваякол	2-метокси-бензенол		плохорастворимый	В этаноле,хлороформе, эфире, ледяной уксусной кислоте	124		470
Пирогал лол	1, 2, 3-тригидрокси-бензол		хорошорастворимый	―	126		405
Гидрохинон	п-дигидроксибензол(бензол-1,4-диол)		плохорастворимый	В ацетоне, диэтиловом эрире, этанол	110		220
Резорцин	м-дигидроксибензол		труднорастворимый	В этаноле, диэтиловом эфире, ацетоне,	110		560
Эозин	2,4,5,7-тетрабромфлуоресцеин		―	В этаноле, плохо раств. в бензоле , хлороформе	648		520
Активный Голубой	винилсульфоновый активный		хорошорастворим	―	551		―
2,4-диметилфенол		(CH3)2C6H3OH	хорошорастворимый	―	122
2,6-диметилфенол	2-окси-м-ксилол	(CH3)2C6H3OH	хорошорастворимый	―	122
этанол	Этиловый спирт	С2H5OH	хорошораств. римый	―	46		―
Продолжение таблицы 1
азур II	халцедона-хризоколлы	C16H18N3SxC15H16N3Sx2 Cl	хорошорастворимый	―	626	―

Для изучения субстратной специфичности исследуемых лакказ микроорганизмов проводили реакции трансформации с выбранными субстратами. Для этого готовили растворы с учетом их молекулярного веса, чистоты препарата и растворимости в воде или других растворителях. Справочные данные приведены в таблице 1.

2.2.2 Методы и среды для культивирования грибов

Культивирование грибов проводили в условиях роста на жидкой или твердой питательной среде следующих составов: среда Чапека (ЧП), модифицированная среда Чапека (ЧМ), cреда Королевой-Скоробогатько (КС), глюкозо-аммонийная среда с кукурузным экстрактом (ГАКЭ), сусло-агар (СА), картофельный агар (КА), составы которых приведен ниже.

Таблица 2 – Состав питательных сред

Компонент	Среда КС (М), г/л	Компонент	СредаЧапека(М), г/л
Глюкоза	20,0	Сахароза	10,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный, KH2PO4	0,6	Натрий азотнокислый, NaNO3	3,0
Магний сернокислый, MgSO4* 7H2O	0,5	Калий фосфорнокислый однозамещенный, KH2PO4	0,3
Калий фосфорнокислый дву- замещенный K2HPO4	0,4	Цинк сернокислый, ZnSO4	0,04
Медь сернокислая, CuSO4*7H2O	0,25	Медь сернокислая, CuSO4*7H2O	0,25
Кальций хлористый, CaCl2	0,5	Калий хлористый, KCl	0,25
Цинк сернокислый, ZnSO4	0,001	Железо сернокислое (II), FeSO4	0,01
Железо сернокислое (II), FeSO4	0, 0005	Марганец сернокислый, MnSO4	0,005
Пептон	3,0	Дрожжевой экстракт	0,2

Компоненты	Среда Королевой-Скоробогатько (Ср-КС) г/л	Глюкозо-аммонийная среда с кукурузным экстрактом (ГАКЭ) г/л
Глюкоза или Сахароза	20 10,0	20,0 -
Пептон	3,0	-
Кукурузный экстракт	-	10,0
Аммоний сернокислый, (NH4)2 SO4	-	2,5
Калий фосфорнокислый дву- или однозамещенный KH2PO4 K2HPO4	0,6 0,4	0,6 0,6
Магний сернокислый, MgSO4* 7H2O	0,5	0,5
Мочевина, (NH2)2CO	-	0,050
Медь сернокислая CuSO4	0,25	0,05
Марганец сернокислый, MnSO4	0,05	0,05
Железо сернокислое (II), FeSO4	-	0,0005
Цинк сернокислый, ZnSO4	-	0,001

Инокулят грибных культур вносили в жидкие питательные среды и культивировали на качалке при температуре 22 – 25° в течение 5 –15 сут. Порядок действий при посеве приведены на рисунке 9.Отбирая пробы на ферментативную активность, оценивали уровень активности лакказы по воздействию на фенолсодержащие субстраты спектрофотометрически и рассчитывали специфическую активность в культуральной жидкости исследуемой грибной культуры.

Рисунок 9―Этапы выращивания посевного мицелия

1 — кусочек мицелия гриба; 2 — пробирка с чистой культурой; 3 — чашка Петри с культурой гриба; 4 — колбы с жидкой средой для глубинного культивирования; 5 — колба с культуральной жидкостью

Для накопления рабочего материала мицелиальных грибов, выделенных из почвы,

растений, в качестве питательных сред для культивирования использовали:

Для приготовления сусло-агара брали пивное сусло 3 – 4 ⁰ Баллинга, добавляли 15 г агар-агара и стерилизовали в автоклаве в течение 0, 5 ч и охлаждали.

Для приготовления картофельного агара брали 1 л картофельного отвара, добавляли 15 г агар-агара и стерилизовали в автоклаве в течение 0, 5 ч и охлаждали.

Агаризованные среды в горячем виде разливали по пробиркам (примерно 1/3 объема), закрывали ватно- марлевыми пробками и стерилизовали в течение получаса при давлении 1,5 атмосферы и температуре 101 °С. После стерилизации пробирки устанавливали на столе в сильно наклонном положении, так, чтобы среда не доходила до пробки на 3-4 см и при застывании имела большую поверхность. После того как среда застыла, в пробирку в стерильных условиях вносили споры или мицелий гриба.

Эту операцию проводили при помощи инокуляционной петли. Во избежание попадания посторонних микроорганизмов инокуляционную петлю перед применением прокаливали над открытым огнем, затем над пламенем горелки открывали пробирку с питательной средой и помещали на нее кусочек мицелия или спор гриба. Петлю вынимали, пробирку закрывали предварительно обожженной над огнем пробкой. Во время этой операции нельзя класть пробку на стол, ее придерживают мизинцем правой руки. Схема действий представлена на рисунке 10 [35].

Рисунок 10 ―Последовательность операций при внесении кусочка мицелия гриба

на стерильную питательную среду

2.2.3 Определение ферментативной активности лакказы

Для определения ферментативной активности лакказы (ЛА) исследуемых грибов проводили трансформацию пирокатехина( или другого фенолсодержащего субстрата) культуральной жидкостью, используя его в качестве субстрата в виде 10 мМ ацетатного буфера при рН=5,0

Контролем в реакции трансформации пирокатехина служил раствор пирокатехина в 0.1 М ацетатном буфере рН5, смешанный с таким же, как и супернатант КЖ, количеством дистиллированной воды [23].

Ферментативную активность лакказы определяли по отношению:

ЛА_К=(ОД_i-ОД₀)/Х t,

где ЛА_К-лакказная активность,

ОД_i- значение оптической плотности реакционной смеси,

ОД₀- значение оптической плотности реакционной смеси на начальный момент времени,

Х- количество фильтрата грибной культуры, взятой для реакции, в мл( или с учетом белка, мг),

t- время инкубации,мин.

На рисунке 11 показано образование продуктов окисления пирокатехина (о-хинона), препаратом лакказы КЖ гриба Х-1.

Рисунок 11 – Фото, иллюстрирующее образование (по потемнению) продуктов окисления пирокатехина (о-хинона), препаратом лакказы КЖ гриба Х-1

Для исследования лакказной активности отбирали пробу КЖ 5-10 мл из колбы с растущим грибом отделяли мицелий фильтрованием через 2-ой бумажный или мембранный фильтр. Для более полного отделения клеток использовали центрифугирование пробы КЖ при 5-8 тыс. об/мин в течение 5-20 мин [28].

Измерение оптической плотности реакционной смеси осуществляли на электрофотоколориметре «ФЭК-2М» при длине волны 410 (440) нм в кювете с длиной оптического шага 1,0 см. Отбор проб (объем 2-5 мл) в реакции трансформации пирокатехина проводили через интервалы времени 0; 10 - 15; 20 - 30; 30 - 50; 60; 0 и 120 мин.,

На основании полученных данных строили график зависимости изменения оптической плотности раствора пирокатехина от времени реакции (ОД _440,t, мин)

Для оценки ферментативной активности определяли концентрацию белка (в мг) в 1 мл КЖ, взятой на анализ.

Для оценки белка (суммарных ферментов) в пробах использовали метод Лоури. Для супернатантов культуральных жидкостей проводили определение белка спектрофотометрическим методом Лоури.

2.2.4 Определение белка по методу Лоури

К 1 мл пробы прилить раствор 2 мл раствора 0,5 н NaOH и кипятили на водяной бане в течение 10 мин. По охлаждению раствора (не взмучивая осадок) отбирали для анализа 1 мл пробы, прилить 5 мл реактива С, перемешали и оставили на 5-10 мин, затем приливали 0,5 мл реактива Д [5]. После развития окраски в течение 20-30 мин колориметрировать на ФЭКе против дистиллированной воды при длине волны 750 нм. Для калибровки использовали раствор яичного (или сывороточного) альбумина с концентрацией 1,5-2 мг/млс шагом 0,1-0,2 мг/мл.

Реактив А: 0.5 г CuSO₄ и 1 г цитрата натрия растворяли в 100 мл дистиллированной воды;

Реактив В: 20 г безводного карбоната натрия и 4 г NaOH растворяли в 1000 мл дистиллированной воды;

Реактив С: (готовили перед определением) смешивая 50 мл реактива В и 1 мл реактива А;

Реактив Д: реактив Фолина разбавляли в 2 раза дистиллированной водой.

Ход анализа белка по методу Лоури:

Рисунок 12 ―Калибровочный график зависимости оптической

плотности стандартного раствора белка от его концентрации

2.2.5 Модифицированная реакция Бавендамма

Реакция Бавендамма обнаруживает наличие окислительных ферментов грибов в процессе роста на питательной среде с субстратом-пирокатехином (0,12%) по образованию окрашенных в темно-коричневый-черный цвета продуктов окисления [3]. Для проведения этого анализа на плотную питательную на среду Чапека, содержащую пирокатехин (в виде пирокатехина диацетата) были высеяны грибы на чашки.