Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Л.И. ЗАКИРОВА МТБ23-10-01.docx
Скачиваний:
0
Добавлен:
01.03.2025
Размер:
3.8 Mб
Скачать

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«Уфимский государственный нефтяной технический университет»

Кафедра биохимии и технологии микробиологических производств

РЕЦЕНЗЕНТ К ЗАЩИТЕ ДОПУЩЕН

Доцент БГАУ Зав. кафедрой

___________ Г.М. Рахимова доктор хим. наук, проф.

_______________ 2012 г. __________В.В. Зорин

Доц., канд хим. наук _____________ 2012 г.

___________В.Г. Сафарова

______________ 2012 г.

МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ

по направлению подготовки «Химическая технология и биотехнология»

по программе «Промышленная биотехнология и биоинженерия»

на тему:

Исследование лакказной активности микроорганизмов

Магистрант Закирова Лиана Ильясовна

Научный руководитель

доцент, канд.техн.наук Л.Х. Халимова

Нормоконтролер Ф.А. Прищепов

УФА 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

  1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1..2 Источники лакказы в природе 8

1.2 Основные свойства лакказ 10

1..3 Структурная организация молекулы лакказы 12

    1. Лигнолитический ферментативный комплекс грибов 15

    1. Лакказа- медиаторные системы 18

    1. очистка фермента лакказы 20

1...7 Области применения лакказ 21

1.8 Роль грибных лакказ в биодеградации лигнина 23

1.9 Роль грибных лакказ в деградации ксенобиотиков 25

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.1 Объекты исследования 30

2.1.2 Материалы исследования 30

2.1.3 Методы и среды для культивирования грибов 32

2.2.3 Определение ферментативной активности лакказы 35

2.2.4 Определение белка по методу Лоури 37

2.2.5 Модифицированная реакция Бавендамма 38

2.2.6 Исследование внутриклеточной лакказной активности грибов 38

2.2.7 Исследование влияния индукторов на лакказную активности

исследуемых грибов 39

2.2.8 Исследование влияния субстрата (косубстрата) на

лакказную активность исследуемых грибов 40

2.2.9 Определение кислотоводорастворимого лигнина в гидролизатах

лигноцеллюлозы по методу Класона 40

2.2.10 Исследование трансформации кислотоводорастворимого

лигнина гидролизатов лигноцеллюлозных материалов 41

2.2.11 Исследование деградации кислотоводорастворимого

лигнина гидрИлизатов лигноцеллюлозных материалов 41

2.2.12 Определение лигнина методом Класона в модификации Комарова 42

2.2.12 Определение эмульгирующей способности культуры грибов 43

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Поиск микроорганизмов - продуцентов лакказ 41

3.2.1 Подбор состава питательных сред для эффективного синтеза

лаказ исследуемых грибов 49

3.2.2 Определение эффективности лакказы грибов, выращенных

в условиях глубиннной и поверхностной культуры 49

3.2.3 Влияние длительности глубинного культивирования

грибных продуцентов на лакказную активность 50

3.2.4 Исследование влияния состава питательной среды на рост

и лакказную активность микроорганизмов 52

3.2.5 Исследование влияния среды культивирования на рост и

лакказную активность мицелиальных продуцентов лакказы 57

3.3 Исследовние субстратной специфичности 61

3.4 Исследование способности грибов обесцвечивать красители 63

3.5. Исследование влияния низкомолекулярных индукторов на

рост и лакказную активность мицелиальных грибов 64

3.4.1 Исследование влияния синтетических индукторов на

биосинтез лакказы микроорганизмами 66

3.4.2 Исследование влияния органических индукторов на

рост и лакказную активность грибов 68

3.5 Исследования ферментных препаратов грибных

лакказ

3.5.1 Исследование субстратной специфичности грибных лакказ 76

3.5.2 Исследование зависимости лакказной активности от 80

температуры

3.5.3 Исследование зависимости лакказной активности от рН 85

3.5.4 Исследование влияния концентраций субстратов на

лакказную активность исследуемых мицелиальных грибов 86

3.5.5 Исследование локализации фермента лакказы у

исследуемых грибов в реакциях трансформации пирокатехина 87

3.5.6 Исследование лакказной активности грибов при росте

на среде с эозином 88

3.5.7 Исследование условий трансформации органических

соединений клеточными лакказами 89

3.5.8 Исследование биодеградации п-нитрофенола 91

3.6 Исследование способности грибных лакказ

стабилизировать эмульсии 98

3.6.1 Исследование условий трансформации пирокатехина

в биоэмульсиях 103

3.7 Исследование трансформации пирокатехина в

двухфазных системах 108

3.8 Изучение биодеградации лигнина мицелиальными грибами 116

3.9 Исследование деградации кислоторастворимого лигнина 120

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

MnП―марганецпероксидаза

МСО―медьсодержащая оксидаза

ЛП―лигнинпероксидаза

ЛМС―лакказа-медиаторная система

ЛА―лакказная активность

ЭА―эмульгирующая активность

ПК―пирокатехин

РЦ―резорцин

ПГ―пирогаллол

РМ―ремазол

ГХ―гидрохинон

2,6 -ДМФ―2,6-диметилфенол

ЧП ―среда Чапека

ГАС ―глюкозо-аммонийная среда

ГАКЭ― глюкозо-аммонийной среде с добавлением кукурузного экстракта

Ср-КС― среда Королевой-Скоробогатько

ОД―оптическая плотность реакционной смеси

КЖ―культуральная жидкость

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время во всем мире ведется интенсивная разработка технологий на основе базидиальных и мицелиальных лигнинолитических грибов и их ферментов для практических целей.

Уникальной особенностью грибов является способность к синтезу внеклеточных окислительных ферментов: лигнинпероксидаз (ЛП), марганецпероксидаз (MnП), полифункциональных пероксидаз, фенолоксидаз ― лакказ, обладающих широкой субстратной специфичностью, что позволяет им разлагать не только органические вещества природного происхождения, но и различные ксенобиотики.

Лакказа (п-дифенол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2)―медьсодержащий фермент, катализирующий окисление субстрата ―донора электронов с сопутствующим восстанавлением молекулярного кислорода до воды без образования в качестве промежуточного продукта перекиси водорода или каких либо других кислородных интермедиатов. Лакказа для катализа не требует кофакторов. Эти качества сделали лакказу одним из наиболее распространенных инструментов в современной биотехнологии.

Применение ферментных препаратов лакказ перспективно во многих областях промышленности: целлюлозо - бумажной (делигнификации бумажной пульпы); текстильной (экологически чистое отбеливание тканей); тонком органическом синтезе (например, синтез электропроводящих полимеров); пищевой (удаление следов кислорода в продуктах питания для увеличения срока хранения); косметической (краска для волос, отбеливающая зубная паста); производстве моющих средств (отбеливающий агент); для биодеградации ксенобиотиков, в том числе отравляющих веществ; синтезе лекарственных препаратов (например, антибиотиков); в биосенсорах (например, анализ фенольных соединений, включая лигнины, в сточных водах промышленных предприятий) определение антиоксидантного статуса продуктов.

В связи с этим производство препаратов лакказ является актуальной задачей биотехнологии. Для использования этих ферментов в индустриальных масштабах требуется их огромное количество. Проблемой является низкая продуктивность используемых микроорганизмов - продуцентов лакказ, что обуславливает их высокую себестоимость. Только понижение себестоимости ферментных препаратов лакказ позволит увеличить масштабы их промышленного производства и использования во многих видах промышленности, сельском хозяйстве, биоремедиации.

Наиболее важными этапами в разработке технологии производства ферментных препаратов лакказ являются выбор высокоактивных штаммов-продуцентов, оптимизация состава питательных сред и условий культивирования на синтез лакказ.

Целью данной работы является поиск новых высокоактивных штаммов ― продуцентов лакказ и исследование лакказной активности в различных условиях культивирования исследуемых грибов.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

  1. Поиск новых высокоактивных штаммов мицелиальных грибов и выявление штаммов с повышенным уровнем синтеза лакказ;

  2. Оптимизация условий культивирования продуцентов лакказ и окисления субстратов в неростовых условиях;

3) Выбор и исследование эффективных индукторов лакказ;

4) Исследование биодеградации ксенобиотиков и лигноцеллюлозных материалов препаратов лакказ исследуемых грибов

Практическая значимость. Результаты работы важны для разработки технологий получения препаратов грибных лакказ для делигнификации лигноцеллюлозных материалов и деструкции ксенобиотиков.

Научная новизна: Выделены и исследованы почвенные мицелиальные грибы- продуценты лакказ, подобраны оптимальные условия их культивирования на различных питательных средах; подобраны эффективные индукторы синтеза лакказ и исследованы условия биодеградации ксенобиотиков и лигноцеллюлозных материалов препаратами мицелиальных грибов.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры БТМП УГНТУ (тема« Научно-образовательная деятельность музея микроорганизмов кафедры биохимии и технологии микробиологических производств»).

Работа была проведена в лабораториях биохимии и биотехнологии кафедры БТМП УГНТУ.

Результаты диссертационной работы были апробированы на 62 и 63 научно-технической конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых [г. Уфа, УГНТУ, 2011 -2012 гг] , были доложены на VI Межвузовский конкурс научных работ студентов по биотехнологии и экологии (УГНТУ 25 апреля 2012 г).

Опубликованы в материалах в I – ой и II - ой Международной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы науки и техники» [г. Уфа, УГНТУ, 8-10 декабря 2010 г.]; в VI Всероссийской научной интернет - конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» [ г.Уфа, УГНТУ, 9- 25 декабря 2011 г.],

Материалы диссертационной работы опубликованы в 2 статьях в Башкирском химическом журнале [2011, т. 18, № 4].

1 Литературный обзор

    1. Источники лакказы в природе

Лакказа была изучена еще в конце 19-го века. В 1883 году Hikorokuro Yoschida описал этот фермент в соке лакового дерева Rhus verniciferа, употребляемом в Японии для лакирования различных изделий. Через несколько лет, в 1886 году, Bertrand обнаружил лаккказу в грибах. Однако широкое изучение лакказ началось только в связи с рассмотрением их роли в деградации древесины дереворазрушающими грибами белой гнили, относящихся к классу Basidiomycetes.  Наибольшее значение из них имеют грибы рода  Tramete (Coriolus) 

(сем. Polyporaceae) [44].

Лакказа продуцируется грибами, растениями, насекомыми и бактериями. Считается, что в растениях лакказы участвуют в синтезе лигнина, катализируя реакцию полимеризации структурных единиц лигнина (таких как, n-кумаровый, конифериловый и синаповый спирты),

которая протекает по свободно-радикальному механизму. Структурные единицы лигнина представлены на рисунке 1.

Рисунок 1―Структурные единицы лигнина

В насекомых фермент лакказа участвует в процессе склеротизации, а также играет важную роль при окислении токсичных соединений.

Лакказоподобные белки, являющиеся представителями многоядерных медных белков, были описаны для разных видов бактерий (грамположительных и грамотрицательных) и есть данные о том, что эти белки вовлечены в синтез белка оболочки эндоспор [18].

Наиболее широко распространена лакказа среди грибов. Известно, что лакказу или лакказоподобные белки продуцируют фитопатогенные аскомицеты, представители которых относятся к родам  Ophiostoma, Melanocarpus, Neurospora, Podospora, Monocillium, Gaeumannomyces и др., а также почвенные аскомицеты – Aspergillus, Curvularia, Penicilium; дереворазрушающие аскомицеты - Trichoderma, Bothryosphaeria, Xylaria [47]; эндофитные грибы Monotospora sp. и Cyathus bulleri [57].

Фенолоксидазная активность обнаружена у лихенизированных аскомицетов, принадлежащих к разным группам: эпигейные и эпифитные лишайники Peltigerales (лакказа и тирозиназа), Lecanorales (только лаккказа). Лакказа обнаружена в микоризных и сапротрофных грибах, таких как  Agaricus [10], Armillariella mellea, Cerrena тахта, Cerrena unicolor, Chaetomium, Coprinus, Coriolopsis, Coriolus hirsutus, Coriolus maxima, Trametes galica, T. multicolor, T.ochracea [46].

Лакказа – это фермент, широко распространенный среди дереворазрушающих грибов. Присутствие этого фермента обнаружено у многих десятков видов базидиомицетов [7]. Среди физиологических групп грибов лакказа является типичной для дереворазрушающих базидиомицетов, разрушающих лигнин, так называемых грибов белой гнили Phanerochaete sordida  и Phanerochaete chrysosporium [50], хотя идентифицирована она и в грибах бурой гнили  Coniophora puteana, Laetiporus sulphureus. Фрагменты гена лакказы обнаружены в таких грибах как Amanita, Cortinarius, Hebeloma, Lactarius, Paxillus, Piloderma, Russula, Xerocomus Tylospora [41].

Основными физиологическими функциями грибных лакказ считаются участие в процессах деградации лигнина, окисление о -, м-, n- фенолов с различными заместителями, полифенолы, ароматические амины, развития морфогенеза грибов, в патогенезе, детоксикации, кроме того, предполагается, что грибная лакказа участвует в синтезе меланина, темного полимерного пигмента, который защищает микроорганизмы от отрицательного внешнего воздействия [43].

Многие авторы изучали возможность использовать биологические объекты для получения лакказы с целью последующего выделения или использования в составе культуральной жидкости. В качестве продуцента лакказы наиболее часто предлагают использовать такие виды Coriolopsis gallica, Coriolopsis polyzona, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius,Phlebia floridensis, Steccherinum ochraceum, Polyporus squamosus, Cerrena maxima, Funalia trogii и другиеи [41].

Для грибов рода Trametes (Т.versicolor) показано, что продукция внеклеточной лакказы составляет у них 95-98 % от общего количества внутри- и внеклеточных лакказ [46]. Лакказа продуцируется также и мицелиальными грибами рода Aspergillus, Fusarium, Penicillum, которые являются неотъемлемой частью биоценоза, участвующие в деградации лигнина растительного опада [11].

Данных об изучениях мицелиальных грибов, как потенциальных продуцентов лакказ, в литературе мало описано, но несмотря на это, известно, что микромицеты являются неотъемлемой частью биоценоза, продуцирующие окислительные ферменты, участвующие в деградации фенолсодержащих органических соединений. Разнообразное сочетание ферментативных комплексов у лигнинразрушающих грибов связано в первую очередь с экологическими особенностями грибов, трофической специализацией и является следствием длительной эволюции растений и грибов [26].

Представители различных таксономических и экологических групп обладают сходным составом ферментов. Однако уровень активности внеклеточных ферментов имеет существенную штаммовую и видовую вариабельность. По оксидоредуктазам отмечена вариабельность как среди штаммов одного вида, так и среди видов каждой группы [18].

В настоящее время во всем мире ведется интенсивная разработка технологий на основе базидиальных и мицелиальных лигнинолитических грибов и их ферментов как для обработки лигниноцеллюлозных материалов, так и для деградации фенолсодержащих органических соединений [1].

    1. Основные свойства лакказ

Лакказа катализирует окисление о- , м- , п- фенолов с различными заместителями, полифенолов, ароматических аминов, а также нефенольных соединений в присутствии медиаторов, восстанавливая кислород до воды согласно следующему уравнению:

АН2+ ½ О2 + ЛАККАЗА А+ Н2О [44].

Основными субстратами, по которым определяют активность лаказы являются: пирокатехин, гваякол, диаммониевая соль 2,2-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты (ABTS), сирингалдазин [42]. Схема окисления субстрата ( м- амещенного фенола) ферментом лакказой представлена на рисунке 2 [18].

С точки зрения строения лакказы микроорганизмов ―это гликопротеины, содержащие углеводные компоненты от 1 до 15% массы фермента, которая состоит из остатков маннозы и N- ацетилглюкозамина. Молекулярная масса лакказ составляет от 43 до 383 kDa, в среднем – 60 - 70 kDа. Изоэлектрическая точка около рН 4,0; рН - оптимум находится в области рН 3,0 –8,0 в зависимости от субстрата (для гидрохинона и пирокатехина он составляет 3,6-4,0 и 3,5-6,2 [ 41,48].

Лакказы дереворазрушающих грибов имеют низкую рН - оптимум окисления фенольных субстратов, совпадающим с оптимумом действия большинства грибных целлюлаз. Так, для лакказ Gaeumannomyces graminis var. Tritici, Coriolus histris он близок к рН 4, 5, а для лакказ других трутовиков Tramenas sanguenea, Poliporus pinsitus составляет рН 4,9 - 5,0 температурный оптимум 25 - 55° С [8].

Рисунок 2―Процесс окисления субстрата ферментом лакказой

Ключевыми характеристиками лакказ являются стандартные окислительно-восстановительные потенциалы трех медных центров фермента (ТІ, Т2 и ТЗ). Потенциал Т1 центра определен для многих лакказ и варьирует от 430 мВ до 780 мВ, в то время как потенциалы Т2 центра определены только для низкопотенциальной растительной лакказы R. vernisifera (390 мВ) и высокопотенциальной грибной лакказы T.hirsuta (400 мВ), а потенциал ТЗ центра для лакказ R. vernisifera (460 мВ) и Т. versicolor (785 мВ) [30,44]. Непосредственно лакказы окисляют только те соединения, потенциал ионизации которых не превышает редокс-потенциал иона меди ТІ центра фермента [51].

Исходя из потенциала Т1 центра все медьсодержащие оксидазы делят на три группы - высоко- , средне- и низкопотенциальные ферменты. К низкопотенциальным лакказам относят ферменты, потенциал Т1 центра которых ниже 430 мВ (Rhus vernicifera) [18], к среднередокспотенциальным – лакказы с потенциалами 470 - 710 мВ, а к высокопотенциальным – те, потенциал которых выше 710 Мв [31].

В традиционном понимании, лакказы представяют собой многоядерные медьсодержащие оксидазы, в литературе их относят к «голубым оксидазам. Типичные лакказы содержат 4 иона меди в активном центре. Ионы меди подразделяют на 3 типа: первый тип или голубая медь (Т1), которая придает ферменту характерный голубой цвет, выполняющая роль переносчика электрона от субстрата к трехъядерному «медному» кластеру к Т1 и Т2, представляющим

собой биядерный медный кластер [30].

«Голубые» лакказы имеют характерную полосу поглощения, близкую к 610 нм. Однако описаны и другие лакказы, которые имели характерный желтый цвет и в его спектре поглащения отсутствовал максимум при 610 нм характерный для типичных синих лакказ. По этим свойствам такие ферменты отнесли к «желтым» лакказам, обнаруженных и описанных в базидиомицетах [11].

Лакказы могут окислять полициклические ароматические углеводороды и другие ароматические соединения. Низкомолекулярные агенты – медиаторы могут усилить лакказозависимую биодеградацию в результате образования высокореакционных радикалов. Так, лакказа разлагает на 40% 2,4-дихлорфенол в концентрации 1 ммоль/л за 12 часов [27].

Каталитические свойства фермента и его широкая субстратная специфичность, возможность использования в качестве субстрата акцептора электронов молекулярного кислорода, способность катализировать реакцию электровосстановления кислорода по безмедиаторному механизму и достаточно высокая стабильность обеспечивают широкое практическое применение лакказ в качестве наиболее часто используемыми окислителями природного происхождения в современных биотехнологиях очистки сточных вод от загрязнений биоцидами, красителями и другими ксенобиотиками [27].

Исходя из широких возможностей применения лакказ, данные ферменты определяют интерес исследователей, делая необходимым поиск и изучение новых эффективных микроорганизмов - продуцентов с целью создания на их основе биокатализаторов для процессов деструкции ксенобиотиков [1].

    1. Структурная организация молекулы лакказы

Лакказа содержит 4 иона меди в активном центре, и состоит из двух медьсодержащих центров (мономолекулярного «голубого» иона меди (Т 1- центр), координированного двумя остатками гистидина и одним остатком цистеина) и трехъядерного медного кластера Т2/Т3, который содержит один ион меди типа Т2, координированный двумя гистидинами, и два иона меди типа Т 3, координированные тремя остатками гистидина каждый [7].

Известно, что эффективность катализа у лакказ зависит от особенностей субстрата – донора электронов и окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) медного центра (Т1) фермента. Следовательно, наибольший практический интерес представляют лакказы с высоким ОВП, поскольку они способны более эффективно разрушать лигнин и другие соединения как фенольной, так и нефенольной природы.

Ионы меди в биологических системах классифицируют согласно их оптическим магнитным свойствам на три типа: T 1, Т 2 и Т3. В активном центре лакказы присутствуют все три типа, однако, несмотря на консервативность его строения, каталитические характеристики различных лакказ значительно отличаются, что, по мнению ряда авторов, определяется значением как окислительно-восстановительного потенциала иона меди первого типа, так и строением белковой и углеводной части фермента. В этой связи особый интерес для исследования представляет группа лакказ с высоким значением окислительно – восстановительного потенциала иона меди первого типа Т 1 [22].

Рисунок 3―Структуры каталитических центров Т1 и Т2/Т3 лакказы из C.hirsutus

Структуры каталитических центров Т1 и Т2/ Т3 лакказы из C.hirsutus представлены на рисунке 3 [27].

Механизм катализа, представленный на рисунке 4, включает окисление субстрата – донора электронов и перенос электрона на Т1 центр фермента. После переноса 4 электронов с иона меди Т1 на кластер Т2/Т3 начинается последовательное восстановление всех трех ионов меди кластера, причем первым восстанавливается ион меди Т 3α, который имеет самое высокое сродство к электрону. Следующей стадией является восстановление Т2 центра. Ключевым шагом в этом процессе является образование “мостикового” гидроксила между Т2 и Т 3β, благодаря которому возможен быстрый электронный перенос на Т 2 центр. Следовательно, эта модель предполагает образование пары ионов меди смешанной валентности. Дальнейшее восстановление иона меди 3β постулируется как быстрый процесс переноса электрона по дипептиду цистеин–гистидин между Т1 и Т3 и сопровождается протонированием “мостикового” гидроксила с последующей диссоциацией двух молекул воды из кластера [18].

Эффективность катализа у лакказ зависит от окислительно-восстановительного потенциала иона меди Т1 (первичного акцептора электронов) и может быть обусловлена несколькими параметрами, главными из которых являются структура субстрат-связывающего кармана и состав формирующих его аминокислотных остатков, а также аминокислотного окружения иона меди Т1. Единого мнения по поводу того, какие же аминокислотные остатки могут оказывать существенное влияние как на величину ОВП, так и на эффективность связывания субстратов, все еще не существует [11].

Ион меди в центре Т1 непосредственно координируется двумя остатками His395 и His458 и остатком Cys453, которые являются строго консервативными у всех лакказ, как показано на рисунке 5 [18].

.

Рисунок 4 – Каталитический цикл окисления субстрата лакказой

Кроме того, в ближайшую сферу окружения попадают также консервативный у всех лакказ остаток Ile455 и остаток Phe337 у высоко редокс-потенциальных лакказ (нумерация остатков по последовательности лакказы из C.hirsutus, который замещен на остаток лейцина у средне редокс-потенциальных лакказ и на остаток метионина у низко редокс-потенциальных). Аминокислотные остатки Phe337 (нумерация по последовательности лакказы C.hirsutus) и замещающий его остаток лейцина для высоко и средне редокс-потенциальных лакказ соответственно находятся на расстоянии превышающем 3,5Å от иона меди Т1 [46].

В настоящее время получены и опубликованы данные по структуре более 100 лакказ из различных источников [11].

Структурный анализ лакказ из различных источников позволил выдвинуть ряд гипотез, ни одна из которых пока не получила экспериментального подтверждения о взаимосвязи между структурой фермента и механизмом его действия. Несмотря на использование самых современных физико-химических методов, наличия большого количества данных по аминокислотной последовательности лакказ и структурных данных, пока не удается ответить на важные с практической и фундаментальной точки зрения вопросы о роли отдельных аминокислотных остатков, формирующих Т1 центр, и что обеспечивает широкую субстратную специфичность фермента на структурном и молекулярном уровнях [32].

Рисунок 5 – Взаимодействие Glu460 и Ser113 вблизи активного центра Т1 структуры C.hirsutus

Таким образом, изучена генетическая организация ряда лакказ и установлена структурно-функциональная особенность данных ферментов, что позволяет понять принципы организации и функционирования медьсодержащих оксидаз и использовать для создания рекомбинантных ферментов с точки зрения их биотехнологического применения [43].

    1. Лигнолитический ферментативный комплекс грибов

Разнообразное сочетание ферментативных комплексов у лигнинразрушающих грибов связано в первую очередь с экологическими особенностями грибов, трофической специализацией и является следствием длительной эволюции растений и грибов. Представители различных таксономических и экологических групп обладают сходным составом ферментов. Однако уровень активности внеклеточных ферментов имеет существенную штаммовую и видовую вареабельность [32].

В неклеточные лигнолитические ферментные комплексы грибов белой гнили включают следующие типы окислительно-восстановительных ферментов: гемсодержащие ферменты, флавинсодержащие ферменты; целлобиозодегидрогеназа; медьсодержащие ферменты [28].

Помимо лигнинразрушающих ферментов эти грибы образуют также системы гидролаз, гемицеллюлозы и целлюлозу:

1) Гемсодержащие ферментысреди которых принято особо выделять лигнинпероксидазы (ЛП) и марганецпероксидазы (МnП). Основная функция этих ферментов - прямое, как у ЛП или опосредованное медиатором (вератролом у ЛП и ионами Мn у МnП) одноэлектронное окисление ароматических субстратов до соответствующих радикалов и двухэлектронное восстановление перекиси водорода до воды.

―Лигнинпероксидаза – гемсодержащий фермент (диарилпропаноксигеназа, Н2О2-зависимая оксигеназа, лигниназа КФ 1.11.1.14) с молекулярной массой 39-42 кДа, являющийся донором Н202, и катализирующий одноэлектронное окисление различных соединений (предпочтительно нефенольных) за счет кислорода перекиси водорода, с восстановлением ее до воды [28]. Лигнинпероксидаза обнаружена лишь у немногих базидиальных грибов:Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Trametes hirsuta, Panus tigrinus, Coriolopsis occidentalis [32].

―Марганецпероксидаза – гемсодержащий фермент (КФ 1.11.1.3) с молекулярной массой

46 кДа, окисляющий фенольные соединения в присутствии перекиси водорода. Проявляет активность в среде, содержащей Мn. Марганецпероксидаза окисляет лигнин путем присоединения к нему не гидроксил-радикалов, а ионов Мn3+, которые при этом восстанавливаются до Мn. Регенерация Мn осуществляется сопряженной реакцией разложения перекиси водорода. При отсутствии в среде Н2О2 Мn-зависимая пероксидаза способна продуцировать пероксид водорода[28]. Мn -зависимая пероксидаза отмечена у таких грибов как Trametes versicolor, Phlebia radiate, Dischomitus squalens [32].

2) Флавинсодержащие ферменты осуществляют в основном двух- электронное восстановление молекулы кислорода до перекиси водорода и одновременно двухэлектронное окисление ОН-группы, соответствующих субстратов, до карбонильных групп. Среди них - глюкозооксидазы, пиранозо-2-оксидазы, метанолоксидазы, арилалкогольоксидазы.

―Глюкозооксидаза катализирует окисление глюкозы, восстанавливая при этом кислород до перекиси водорода. Глюкозооксидаза выявлена у грибов Partus tigrinus, P.Chrysosporium [32].

―Пиранозо-2-оксидаза - флавинсодержащая оксидаза с молекулярной массой 120 кДа, катализирует окисление низших первичных и ароматических спиртов до соответствующих альдегидов и пероксида водорода [27].

―Арилалкогольоксидаза (вератрил-алкоголь оксидаза) - внеклеточная флавиноксидаза с молекулярной массой 72,5-78кДа; катализирует окисление ароматических спиртов до альдегидов, восстанавливая кислород до перекиси водорода [32].

― Метанолоксидаза (МеО) - внеклеточный флавинсодержащий фермент с молекулярной массой 75кДа, катализирует окисление метанола до формальдегида, восстанавливая кислород до перекиси водорода. Выделена и охарактеризована у Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Partus tigrinus [27].

3) Целлобиозодегидрогеназа - флавин и гемсодержащая внеклеточная оксидоредуктаза грибов с молекулярной массой 90-97кДа, катализирует окисление целлобиозы до целлобионо-лактона, восстанавливая различные электронно-донорные субстраты (О2 до Н2О, Fe до Fe, Мn до Мn, хиноны до фенолов и др.) Целлобиозодегидрогеназа (ЦЦ) была выделена у Partus tigrinus, P. chrysosporiumи других грибов белой гиили, а также у грибов бурой и мягкой гнили древесины [28].

4) К медьсодержащим ферментам относятся  катехолоксидаза и лакказа катализируют включение кислорода в молекулу субстрата [52].

―Катехолоксидаза участвует в гидроксилировании монофенолов до дифенолов и окислении дифенолов в ортохиноны. Она широко распространена среди микроорганизмов и имеет названия, соответствующие катализируемому субстрату: монофенолоксидаза, полифенолоксидаза, фенолаза, крезолаза, тирозиназа и др.

―Лакказа (п-дифенол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) относится к классу оксидаз; молекулярная масса лакказ составляет от 43 до 383 kDa, в среднем - 60-70 kDa; участвуюет в окислении фенолов с различными заместителями, ароматических аминов, восстанавливая молекулярный кислород до воды [55].

    1. Лакказа - медиаторные системы

Интерес к практическому использованию лакказ возрос в середине 90-х годов ХХ века, после открытия возможности усиления действия этих ферментов с использованием различных редокс-медиаторов, что позволило существенно расширить область их практического применения. Медиаторы лакказ представляют собой субстраты этих ферментов, окисление органических соединений протекает по свободно-радикальному механизму, который в настоящее время до конца не изучен и, поэтом до сих пор остается неясным детальный механизм функционирования и принципы регуляции активности данного класса ферментов [31].

В течение ряда лет проводились интенсивные исследования лакказ на способность окислять широкий круг специфических органических и неорганических соединений. В 1990 г. была открыта возможность использования субстрата лакказ АБТС в качестве медиатора или усилителя действия лакказ. Было показано, что лакказа T.hirsuta в присутствии АБТС и ремазола голубого способна окислять нефенольные высоко редокс-потенциальные компоненты лигнина – вератровый спирт и 1-(3,4 - диметоксифенил)-2- (2- метоксифенокси) пропан-1,3- диол [56].

В идеальном случае, при отсутствии побочных реакций, редокс-медиатор фермента может осуществлять большое число циклов, не претерпевая при этом деструктивных превращений. Принцип действия лакказа - медиаторных систем отражен на рисунке 6 [56].

Рисунок 6―Лакказа-медиаторная система

Так же были исследованы окислительно-восстановительные свойства других медиаторов – гидроксибензотриазола, полиоксиметаллаты [SiW11V1O40]5- и т.д.

К сожалению, в настоящее время нет соединений, полностью удовлетворяющих требованиям, предъявляемым к редокс-медиаторам лакказ. В первую очередь это связано с низкой стабильностью образующихся в процессе ферментативной реакции интермедиатов и, как следствие, низким числом редокс-циклов в процессе каталитического окисления нефенольных соединений [58]. К усилителям можно отнести как истинные редокс - медиаторы лакказ, которые не расходуются в процессе многократных циклических превращений и продукты ферментативного окисления которых имеют высокий редокс-потенциал, так и соединения, в процессе окисления которых образуется активный радикал, способный к дальнейшим превращениям. Описано только небольшое число соединений, которые хотя и не являются "идеальными" (истинными) редокс - медиаторами, но могут осуществлять значительное число редокс-циклов [45].

В последние годы появилось большое количество публикаций, посвященных поиску и исследованию механизма функционирования новых усилителей действия лакказ, которые, во-первых, нетоксичны и, во- вторых, имеют низкую стоимость и высокую эффективность. Подавляющее большинство из них не являются истинными редокс - медиаторами, так как после одного или нескольких циклов выходят из реакционного процесса в результате вторичных химических превращений. Наиболее часто в качествередокс-медиаторов используются соединения, в состав которых входят структурные группы N-OH и N-O. К этим соединениям относится виолуровая кислота и N- гидроксиацетанилид [32].

Была предложена схема отбора потенциальных медиаторов лакказ и экспериментальные методы их тестирования, включающая 4 стадии [56]:

― Отбор соединений на основе анализа структурной формулы с учетом необходимости наличия сопряженных связей и гетероциклических атомов, а также ОН - и NH2- гpyпп;

― Определение каталитических характеристик отобранных соединений в гомогенных ферментативных реакциях, катализируемых лакказой;

― Анализ циклических вольтамперограмм растворов отобранных соединений в отсутствии и в присутствии модельных соединений лигнина;

― Прямой эксперимент по анализу продуктов окисления модельного соединения лигнина системой медиатор - лакказа.

С помощью предложенной схемы найден новый класс соединений (потенциальных медиаторов лакказ) с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5.

Эти соединения относятся к гетероциклическим соединениям, содержащим в своем составе два заместителя электрон-донорной природы - метильную и фенильную группы, и присутствуют в растворе в виде двух таутомерных формах. Показано, что при электрохимическом и ферментативном окислении этих соединений образуются высокопотенциальные промежуточные соединения, способные окислять модельное соединение лигнина – вератровый спирт [31]. Контрольные эксперименты показали, что в отсутствии лакказы исследуемые медиаторы практически не способны к окислению вератрового спирта, а лакказа в отсутствии медиаторов окисляет менее 2% вератрового спирта [42].

    1. Очистка фермента лакказы

Известны способы получения очищенных препаратов лакказы [34], и в составе других ферментных препаратов [33].

Однако они сложны, многоэтапны, так как включают в себя комбинацию разных методов очистки: высаливание, многоступенчатая хроматография на различных носителях и требуют для своего исполнения сложного и дорогостоящего аппаратурного и реактивного обеспечения.

Например, оптимизированная схема очистки включает следующие стадии [29]:

1) Получение исходного ферментного препарата. Культуральная жидкость (КЖ) отделяют от мицелия фильтрованием, затем концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах с помощью разделительного аппарата.

2) Белки КЖ осаждают (NH4)2SO4 при 90% от насыщения. Осадок растворяют в буфере А, диализуют против буфера.

3) Анионообменную хроматографию проводят на колонке с ДЭАЭ-сефацелем, уравновешенную буфером А. Элюируют белок градиентом 0 - 1М NaCl в буфере А, скорость элюции 1 мл/мин, фракции по 5 мл. Фракции с активностью лакказы объединяют, диализуют против

1М (NH4)2SO4 в буфере А. Применение ДЭАЭ-сефацеля позволяет отделить фермент от пигмента, присутствие которого нежелательно из-за его необратимой адсорбции на носителях при последующих стадиях хроматографии.

4) Диализованный препарат наносят на колонку с Phenyl-Sepharose, уравновешенную 1 М (NH4)2SO4 в буфере А. Гидрофобная хроматография на колонках с фенил-сефарозой позволяет получить гомогенный белок .Белки элюируют градиентом 1 - 0 М (NH4)2SO4 в буфере А со скоростью 1 мл/мин, объем фракций 5 мл. Активные фракции объединяют, диализируют против буфера В.

5) Анионообменная хроматография на MonoQ5/50 GL. Препарат наносят на колонку, предварительно уравновешенную буфером В. Скорость нанесения 0,5 мл/мин. Связавшиеся белки элюируют линейным градиентом 0 - 0,5 М NaCl в буфере В. Скорость элюции 0,5 мл/мин, объем фракций 1 мл.

6) Разделение изоформ достигается в ходе проведения изоэлектрофокусирования препаративной (ИЭФ) в слое гранулированного геля Sephadex IEF. Две четкие зоны геля Sephadex, содержащие изоформы лакказы, собирают по отдельности. Sephadex из каждой зоны переносят в колонки 130 х 25 мм, суспендируют в буфере В , давая осесть гелю, а затем элюируют лакказу примерно четырьмя - пятью объемами буфера В по отношению к объему исходного геля Sephadex. Гомогенность каждого препарата проверяют с помощью SDS-электрофореза. Полученный препарат лакказы концентрируют с помощью микроконцентратора Vivaspin 2.

7) Удаление амфолинов из препарата фермента проводят в ходе гельфильтрации на Superdex 200, уравновешенной буфером В. Элюируют лакказу тем же буфером, скорость элюции 0,8 мл/мин, объём фракций 1 мл. Полученные активные фракции объединяют, концентрируют с помощью микроконцентраторов Vivaspin 2. Гомогенность полученного препарата проверяется электрофоретически, а также идентичностью N-концевых аминокислотных последовательностей очищенных белков.

    1. Области применения лакказ

Основной трудностью в работе с лакказами является то, что затруднительно определять лакказу по воздействию на субстрат, ввиду ее очень широкой субстратной специфичности, которая варьирует от одной лакказы к другой, а спектр субстратов перекрывается со спектром субстратов тирозиназы. Хотя лакказу называют дифенолоксидазой, монофенолы, такие, как 2,6-диметоксифенол или гваякол, часто оказываются лучшими субстратами для лакказы, чем дифенолы, такие как пирокатехин или гидрохинон [47]. Некоторые авторы, ссылаясь на работу [53], рассматривают сирингалдазин как исключительный субстрат лакказы в условиях, когда пероксид водорода, способный также окислять сирингалдазин, устранен из сферы реакции. Лакказа окисляет также полифенолы, метокси-замещенные фенолы и ароматические диамины, но не окисляет тирозин, как это делает тирозиназа [49].

Одним из примеров использования лакказа-медиаторной системы является делигнификация и обесцвечивание бумажной пульпы, вторичной переработки макулатуры и детоксикация промышленных отходов. Принцип функционирования таких систем состоит в ферментативном окислении медиаторов лакказ с образованием продуктов с высокими редокс - потенциалами. Последние могут взаимодействовать с карбогидратами, лигнином или другими экотоксикантами (красители, пестициды и др.) и проводить их деструкцию [35].

Препараты грибных лакказ и их иммобилизованные формы эффективны при очистке сточных вод гидролизно-дрожжевого производства, содержащих фенольные соединения, при удалении лигнинсодержащих примесей в обработке текстиля [16].

Лакказы широко используются в текстильной промышленности для обработки льна, обесцвечивания и окрашивания хлопковых тканей [33, 35, 39]; известно использование лакказы в косметической промышленности в качестве агента для окрашивания волос [33, 34, 36, 40]; для производства отбеливающей зубной пасты, в производстве моющих средств [37]; в иммуноферментном анализе в качестве фермента-маркера [25, 26, 35].

В пищевой промышленности лакказа используется при изготовлении драже и жевательной резинки, освежающей дыхание. Хиноны, образующиеся в процессе реакции, связываются со специфическими соединениями серы, которые обусловливают неприятный запах изо рта. В редких случаях фермент используют при изготовлении пива для предотвращения появления посторонних запахов [37].

При изготовлении белого виноградного вина использование лакказы способствует удалению фенолов. Лакказа также используется для определения антиоксидантной активности красных вин [18]. Добавление лакказы в состав чая, кофе, какао способствует более интенсивному окрашиванию напитков в коричневый цвет. В настоящее время для получения лакказы используют генетически модифицированные микроорганизмы Aspergillus oryzae и  Trichoderma viridae [24].

В современных условиях, когда особое значение приобретает проблема охраны окружающей среды, большое внимание уделяется способности дереворазрушающих грибов разрушать такие вещества как 2,3,7,8- тетрахлоробензо-п-диоксин, линдан и бензопирен [45]. Лакказы-очень эффективные агенты, используемые для биодеградация ксенобиотиков [35], в том числе фенольных отходов [36], 2,4- дихлорфенола и пентахлорфенола, гербицидов (атразина) [56,58]; для создания антимикробных композиций [39].

Активные ферментные комплексы дереворазрушающих грибов могут быть использованы в промышленности для обесцвечивания сточных вод. Лакказу применяют в биосенсорах, для анализа фенольных соединений [27]. Показана возможность использования лакказы Coriolus versicolor для определения фенолов [17] включая лигнины, в сточных водах промышленных предприятий [40].

Таким образом, актуальной задачей биотехнологии является разработка технологий производства ферментного препарата лакказы. Однако в настоящее время недостаточно изучены вопросы влияния компонентов питательной среды и условий культивирования на синтез лакказы в условиях глубинного культивирования. Важнейшими этапами разработки технологии является разработка стадии культивирования и, в частности: выбор высокопродуктивного штамма, выбор основного сырья и дополнительных компонентов, оптимизация количественного состава питательной среды, оптимизация условий культивирования и разработка технологии выделения.

    1. Роль грибных лакказ в биодеградации лигнина

Лигнин (от лат. lignum — дерево, древесина)―сложное полимерное соединение, содержащееся в клетках сосудистых растений. Относится к инкрустирующим веществам оболочки растительной клетки. Отложение лигнина в клеточных оболочках вызывает одревеснение клеток и увеличивает их прочность [7]. Древесина лиственных пород содержит 18-25 % лигнина, хвойных - 23-50 %, в соломе злаков 12 - 20 % от массы; у низших растений (водоросли, грибы) и мхов лигнин не обнаружен. Одревесневшие клеточные оболочки обладают ультраструктурой, которую можно сравнить со структурой железобетона [11].

В химическом отношении лигнин неоднороден. Он представляет собой весь­ма сложное соединение, субъединицы лигнина―это производные фенилпропана, главным образом конифериловый спирт у хвойных пород, лигнин лиственных пород содержит конифериловый и сина­повый спирты, а лигнин злаков-еще и кумаровыи спирт. Эти различия отражаются прежде всего в содержании метоксильных групп: в лигнине лиственных пород оно варьирует в пределах от 20,5 до 21,5%, в лигнине хвойных - от 15 до 16%, а в лигнине злаков - от 14 до 15% [14].

Слож­ность строения лигнина обусловлена разнообразием связей, при помощи ко­торых мономерные блоки соединены друг с другом. Такое нерегулярное строе­ние согласуется с представлением о том, что при синтезе лигнина ферменты участвуют лишь в образовании радикалов кониферилового спирта; эти радикалы уже спонтанно вступают затем в различные связи, причем характер возни­кающих связей определяется мезомерным состоянием радикалов [11].

Фенилпропаноидные единицы в молекуле лигнина различным обра­зом соединены между собой при помощи эфирных и углерод - угле­родных связей. На рисунке 8 представлены фенилпропаноидные единицы лигнина [20]. При действии кислот в лигнине могут гидролизоваться углерод-кислородные связи, но сохраняются существующие в нем углерод - углеродные связи и об­разуются новые. Эти связи чрезвычайно устойчивы к действию ферментов [12].

Рисунок 7―Исходные вещества для биосинтеза лигнина (слева) и димеры кониферолового спирта, образующиеся как промежуточный продукт при синтезе и распаде лигнина

Грибы, разрушающие древесину, а также почвенные грибы и бактерии разлагают лигнин гораздо медленнее, чем целлюлозу и гемицеллюлозы. Некоторые грибы могут разрушать лигнин да­же в живых растениях [11].

Известно, что биодеградация лигнина имеет выраженный окислительный характер. Она происходит в боковых цепях, которые окисляются с образованием карбонильных и α -карбоксильных групп, и в ароматическом ядре, которое окисляется в результате деметилирования и введения гидроксильных групп в фенольные остатки с образованием 2,3- и (или) 3,4-дигидроксифенильных остатков [53].

Различные структуры лигнина деградируются внеклеточными ферментами дереворазрушающих, которые атакуют низкомолекулярные и полимерные субстраты [20]. Базидиомицеты, разрушающие древесину можно разделить на две группы:

- Возбудители бурой гнили превращают древе­сину в красновато-коричневую массу; они разрушают главным образом целлюлозные и гемицеллюлозные компоненты древесины и не дей­ствуют на фенилпропановые полимеры.

-Возбудители белой гнили разру­шают древесину с образованием почти белой массы; они действуют в первую очередь на лигнин и почти не затрагивают целлюлозу [44]:

К гри­бам, разрушающим лигнин, относятся  Polystictus versicolor  и некоторые другие (например, Stereum hirsutum). Есть также грибы, дей­ствующие одновременно на лигнин и целлюлозу; таковы Pleurotus ostreatus,Ganoderma applanatum,Polyporus adustus, Armillaria  Mellea [53].

    1. Роль грибных лакказ в деградации ксенобиотиков

Разложение персистентных ксенобиотиков, в том числе суперэкотоксикантов (диоксинов), представляет собой серьезную экологическую проблему, так как они обнаруживаются в почвах и грунтовых водах через многие годы после завершения применения [45].

Способность грибов к деградации ксенобиотиков ароматической природы связана с их приспособленнностью к трансформации лигнина - сетчатого фенилпропаноидного полимера нерегулярного строения, который является основным неуглеводным компонентом растительного опада. Основные пути разложения природных полимеров и ксенобиотиков грибами представлены на схеме 8 [42].

Наименее изучены механизмы разложения ксенобиотиков ароматической природы почвенными мицелиальными грибами. Между тем, именно они, наряду с бактериями, составляют основную массу обитателей почв и перерабатывают большую часть лигнина, поступающего в почву [20].

У почвенных грибов ключевую роль в разложении ароматических ксенобиотиков отводят лакказам, способным конденсировать их с низкомолекулярными предшественниками гуминовых кислот или фульфокислот [18]. Результатом является частичная минерализация, а также образование гумусовых веществ. У бактерий разложение ксенобиотиков ароматической природы может обеспечиваться, например, системой ферментов, включающей катехол-1,2-диоксигеназы, муконатциклоизомеразы, диенлактон-гидролазы и муконолактон-изомеразы [53].

Рисунок 8―Основные пути разложения природных полимеров и ксенобиотиков грибами

Способность грибных лакказ обесцвечивать различные красители, присутствующие в сточных водах текстильной промышленности, хорошо изучена [43, 48, 74,83]. Суммируя существующие данные, можно сказать, что обесцвечивание красителей лакказой базидиальных грибов показано для 31 вида и 77 красителей и их смесей. При этом среди исследованных базидиальных грибов роды Phanerochaete и Trametes охарактеризованы наиболее подробно, как способные к разложению широкого класса красителей. Однако запатентованным в настоящее время является только препарат на основе Flavodon flavus [84], что свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения базидиальных грибов, родов Phanerochaete и Trametes, которые могут быть использованы для биоремедиации сточных вод текстильной промышленности [18].

Биологическая очистка вод от радионуклидов и тяжелых металлов с помощью грибов основана на их способности интенсивно поглощать токсиканты. При этом поглощение металлов грибами может происходить не только вследствие адсорбционных процессов, как в случае бактерий, но также и благодаря активному транспорту металлов в клетки [35]. Эта уникальная способность грибов делает их в ряде случаев оптимальными агентами биологической очистки от металлов и радионуклидов. В качестве грибов, способных к интенсивному поглощению радионуклидов и тяжелых металлов, рекомендовали аскомицеты Aspergillus, Penicillium и Phizopus [42].

В последнее время, однако, все большее внимание уделяется изучению в качестве потенциальных биосорбентов базидиальных грибов, что объясняется, по-видимому, их меньшей патогенностью. Высокие концентрации тяжелых металлов в среде токсичны для базидиальных грибов, поэтому при выборе штамма необходимо исследование чувствительности конкретного вида гриба. Согласно данным, полученным в работе [56], высокой устойчивостью к металлам обладают Pleurotus ostreatus, P. cystidosus, Stereum hirsutum устойчивы к кадмию и ртути и Trametes versicolor (устойчив к Cd, Zn, Ni, Co, Cr, Mo, Pb, Hg, Sn).Способностью аккумулировать наиболее широкий спектр тяжелых металлов обладают грибы родов Pleurotus, Trametes и Phanerochete, что делает представителей этих родов наиболее перспективными с точки зрения использования в технологиях биологической очистки сточных вод от тяжелых металлов [44].

В классической схеме очистки от нефти и нефтепродуктов биологические методы использовали только на завершающей стадии очистных мероприятий, однако сейчас отмечается тенденция к замене многостадийных схем очистки на одностадийные [18].

В основе разрабатываемых подходов лежит использование консорциумов микроорганизмов, к которым относятся представители мицелиальных грибов, дрожжей и бактерий, эффективно трансформирующих компоненты нефти в нетоксичные и малотоксичные вещества. При этом очистка нефтезагрязненных сред в in situ может осуществляться как с помощью поддержания и стимулирования естественной нефтеокисляющей микрофлоры путем создания оптимальных условий для ее развития (аэрация, внесение в очаг загрязнения азотнофосфорных удобрений), так и введением активного штамма деструктора в место загрязнения [56].

Для очистки водной поверхности от нефтяных загрязнений в нашей стране разработан комплексный микросорбент, содержащий штаммы грибов аскомицетов Fusarium solani, F. moniliforme, Trichoderma harzianum и Cladosporium resinae [22]. Указанные грибы иммобилизуют на гидрофобных носителях и используют в качестве сорбентов и деструкторов нефти [22]. Для очистки почвы и водных поверхностей от нефти и нефтепродуктов разработан и применяется комплексный препарат, содержащий как грибы класса аскомицеты (Aspergillus niger), так и базидиомицеты (Phanerochaete chrysosporium), предназначенный для распыления по водной поверхности в смеси с детергентами и сорбентами [46]. Аналогичные препараты, содержащие штамм Phanerochaete chrysosporium и предназначенные для очистки сред, загрязненных нефтяными углеводородами, зарегистрированы в США [37].

Для очистки почв от нефтяных загрязнений применяют биопрепараты, содержащие в своем составе, главным образом, бактерии, такие как Pseudomonas,Rhodococcus, Bacillus, Arthrobacter, Acinetobacter, Azotobacter, Alkaligenes, Mycobacterium, а также дрожжи Candida и нитевидные актиномицеты Streptomyces. В препаратах грибного происхождения используются преимущественно аскомицеты родов Aspergillus и Penicillium [53], а среди базидиальных грибов высокая нефтедеструктивная способность показана только для родов Phanerochaete, Pleurotus и Trametes. В присутствии P.chrysosporium, P. ostreatus и T. (Coriolus) versicolor через 12 месяцев после инокуляции количество нефтяных углеводородов снижалось на 68.7, 53.1 и 78.1%, соответственно [44].

Особенностью биоразложения нефтяных углеводородов грибами является их способность метаболизировать ароматическую фракцию ароматических углеводородов, тогда как бактерии разрушают преимущественно парафинонафтеновые углеводороды [49]. Патентов, содержащих описание препаратов на основе базидиальных грибов и предназначенных для очистки почв, загрязненной нефтью, в РФ нет. В США зарегистрирован единственный патент, содержащий описание способа очистки нефтезагрязненных сред с использованием P. chrysosporium [40].

Наряду с разложением природных полимеров (лигнин, целлюлоза, гуминовые вещества), в литературе встречаются данные о способности базидиальных грибов разлагать синтетические полимеры. Синтетические полимеры (пластмассы) широко используются в современном мире. Вследствие их чрезвычайной устойчивости и постоянное накопление в окружающей среде актуален поиск путей биодеградации [49].

Выраженная деполимеризация, регистрируемая по уменьшению количества C–H связей, была продемонстрирована для P. chrysosporium, P. sajor caju, и Polyporus versicolor; наименьший деполимеризационный потенциал был отмечен для видов, принадлежащих к роду Pleurotus. Согласно данным [45], гриб Pycnoporus cinnabarinus обладал способностью к разложению другого синтетического полимера – поливинилового спирта – применяемого в качестве клея. Авторами был показана взаимосвязь разложения полимера с продукцией лакказы.

Для грибов P. chrysosporium и Trametes versicolor была продемонстрирована способность разлагать такой полимер как нейлон, широко используемый в текстильной промышленности [49]. Позднее выделение и характеристика фермента, ответственного за разложение полимера, показали его сходство с MnП [53].Была показана способность базидиальных грибов разлагать остатки резиновых покрышек. Было установлено, что наиболее эффективным, по-видимому, является Resinicium bicolor. При обработке используемых в качестве добавок к резине ароматических соединений Resinicium bicolor было отмечено усиление роста на резине бактерий Thiobacillus ferrooxidans, а также ускорение процессов девулканизации [54].

Таким образом, использование грибов и их окислительных ферментов, в том числе лакказ, в технологиях переработки и утилизации техногенных образований и отходов возможно по следующим основным направлениям:

- очистка загрязненных вод (в том числе сточные воды текстильной промышленности и ЦБК;

воды, загрязненных нефтяными углеводородами [11];

-сточные воды, образующиеся при производстве оливкового масла; жидкие отходы, образую

щиеся при производстве сахара из сахарной свеклы или сахарного тростника [22,42];

-водной суспензии, остающейся после коагуляции латекса припроизводстве резины [54];

-сточные воды, содержащие тяжелые металлы и радионуклиды [35,42];

–очистка загрязненных почв, в том числе, загрязненных ксенобиотиками и, тяжелыми металлами [44];

– разложение труднодеградируемых субстратов, в том числе лигнин и лигнинцеллюлозных отходов, низкоэнергетических углей и синтетических полимеров [20,22,49].

Таким образом, задачей биотехнологии является разработка технологий производства ферментного препарата лакказы, так как применение препаратов лакказ перспективно во многих областях промышленности: целлюлозо-бумажной (делигнификации бумажной пульпы); текстильной (экологически чистое отбеливание тканей); тонком органическом синтезе (например, синтез электропроводящих полимеров); пищевой (удаление следов кислорода в продуктах питания для увеличения срока хранения); косметической (краска для волос, отбеливающая зубная паста); производстве моющих средств (отбеливающий агент); для биодеградации ксенобиотиков, в том числе отравляющих веществ; синтезе лекарственных препаратов (например, антибиотиков); в биосенсорах (например, анализ фенольных соединений, включая лигнины, в сточных водах промышленных предприятий) определение антиоксидантного статуса продуктов [36, 45, 49].

Благодаря очень широкой субстратной специфичности использование грибных лакказ для деградации лигноцеллюлозных материалов и ксенобиотиков очень перспективна и актуальна, поэтому ведутся интенсивные работы в области разработки подходов к деградации ксенобиотиков и лигноцеллюлозных материалов, получению рекомбинантных штаммов продуцентов этих ферментов и увеличению эффективности катализа, рН и термостабильности [29].