Ход работы:

Непрямая реакция. В пробирку отмеривают 1 мл сыворотки крови, 2 мл этилового спирта и фильтруют. К фильтрату добавляют 5 капель свежеприготовленного диазореактива – появляется красно-розовое окрашивание.

Прямая реакция. На часовое стекло, под которое положен лист белой бумаги, наносят каплю сыворотки крови, содержащий прямой билирубин, добавляют 3 капли свежеприготовленного диазореактива и перемешивают стеклянной палочкой. Образуется характерное для билирубина красное окрашивание.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 11.

Ортотолуидиновый метод: определение глюкозы в сыворотке крови.

Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты дает синезеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на фотоэлектроколориметре:

Орто-толуидин глюкоза

С ортотолуидиновым реактивом реагируют все альдогексозы, но их содержание в крови невелико, поэтому метод позволяет определить практически одну глюкозу.

РЕАКТИВЫ: 1. Трихлоруксусная кислота, 3%-ный раствор.

2. Ортотолуидиновый реактив.

3. Стандартный раствор глюкозы, 1 г/л (100 мг % раствор), готовят ex tempore.

ОБОРУДОВАНИЕ: Центрифуга, центрифужные пробирки, микропипетка вместимостью 0,1 мл, пипетка вместимостью 1 мл, ФЭК, кровь или сыворотка крови.

Ход работы:

В две пробирки наливают по 0,9 мл (18 капель) 3%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, затем в одну из них вносят 0,1 мл (2 капли) крови, взятой из пальца (или сыворотка крови), а в другую – 0,1 мл (2 капли) стандартного раствора глюкозы. Содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 10 минут. Для определения берут по 0,5 мл (10 капель) надосадочной жидкости из каждой пробирки, вносят в обычные сухие пробирки, добавляют по 4,5 мл ортотолуидинового реактива и помещают пробирки в кипящую водяную баню на 8 мин. Необходимо следить, чтобы вода в бане непрерывно кипела. Вынимают пробирки и охлаждают их водопроводной водой до комнатной температуры. Затем измеряют на фотоэлектроколориметре оптическую плотность проб в кюветах на 10 мм против воды с красным светофильтром (620 нм); поскольку контроль на реактивы на ФЭК равен нулю, окраска ортотолуидинового реактива не развивается.

РАСЧЕТ: Содержимое глюкозы в опытной пробе рассчитывают по стандартному раствору глюкозы по формуле:

Сст  Еоп

Соп = ——————,

Ест

где Соп – концентрация глюкозы в крови в пробе, ммоль/л; Сст – концентрация глюкозы в стандартной пробе,100 мг/100 мл; Еоп – оптическая плотность пробы; Ест – оптическая плотность стандарта глюкозы. Коэффициент пересчета в единицы СИ (ммоль/л) равен 0,0555.

Нормальное содержание глюкозы в сыворотке крови человека, определяемое ортотолуидиновым методом, колеблется в пределах 3,33-4,99 ммоль/л (60-90 мг%).