Московский государственный университет тонкой химической технологии им.М.В.Ломоносова
Кафедра БМиФТ
Реферат на тему:
«Высокоэффективная жидкостная хроматография»
Выполнили: Еремкин Н.В.
Корепанова И.В.
Проверил: Станишевский Я.М.
Москва,2012
Основные понятия
Хроматография — метод разделения, анализа и физико-химических исследований веществ, основанный на распределении исследуемого вещества между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент).
Неподвижная фаза представляет собой сорбент, а подвижная – поток газа или жидкости. Поток подвижной фазы фильтруется через слой сорбента или перемещается вдоль слоя сорбента.
Жидкостная хроматография - метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой является жидкость
ВЭЖХ – это высокопроизводительная быстрая колоночная жидкостная хроматография, применяемая для разделения органических проб сложного состава.
Процесс анализа пробы делится на 2 этапа:
разделение пробы на составляющие компоненты;
детектирование и измерение содержания каждого компонента.
История разработки метода
Первооткрывателем хроматографии был русский ученый, ботаник и физикохимик М. С. Цвет (1900 – 1902). Исследуя пигменты растений, Цвет пропустил раствор смеси очень мало различающихся по цвету пигментов через трубку, заполненную адсорбентом – порошкообразным карбонатом кальция, и промыл затем адсорбент чистым растворителем. Отдельные компоненты смеси при этом разделились и образовали цветные полосы.
Хроматографию сначала использовали очень редко, ее скрытый период длился около 20 лет и только в 1931 г. Р. Куну (Германия) разделил каротиноиды хроматографическим методом, возродив способ, предложенный М.С. Цветом.
Лауреат Нобелевской премии по химии (1938), А. Винтерштейну (Германия) и Э. Ледереру (Франция), удалось выделить этим методом a- и b-каротин из сырого каротина и тем самым продемонстрировать ценность открытия Цвета.
Важным шагом было открытие А. Мартином и Р. Сингом (Англия) варианта жидкостной распределительной хроматографии на примере разделения ацетильных производных аминокислот на колонке, заполненной силикагелем, насыщенным водой, с использованием хлороформа в качестве растворителя (1940). Тогда же было отмечено, что в качестве подвижной фазы может быть использована не только жидкость, но и газ.
В конце 60-х гг. резко возрос интерес к жидкостной хроматографии. Появилась высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Этому способствовало создание высокочувствительных детекторов, новых селективных полимерных сорбентов, новой аппаратуры, позволяющей работать при высоких давлениях. В настоящее время ВЭЖХ занимает ведущие позиции среди других методов хроматографии и реализована в различных вариантах
Оборудование жх
1)Элюент.
Требования к элюенту:
Выделяемые вещества не должны взаимодействовать с элюентом или разрушаться при его присутствии.
Элюент может быть или индивидуальным растворителем или смесью нескольких растворителей. Растворители должны легко удаляться после выделения.
Если под действием растворителей различной полярности (полярных и неполярных) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту.
2) Хроматографическая колонка и количество сорбента. Представляет собой стеклянную трубку, один из концов которой имеет пористую насадку или заткнут кусочком ваты, для того чтобы сорбент не высыпался.
3) Сорбент.
Выбирается исходя из свойств разделяемой смеси.
Требования к сорбенту:
Разделяемые вещества не должны разрушаться в присутствии.
Если под действием растворителей различной полярности (полярных и неполярных) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту (от полярного сорбента к неполярному и наоборот).
4) Приемники фракций.
Для сбора фракций можно использовать как обычные плоскодонные колбы, так и пробирки. Когда разделяемые вещества окрашены, видно как они выходят с колонки. Каждое вещество собирают в отдельный приемник. Если вещества выходят смесью - смесь собирают отдельно. Если разделяемые вещества не окрашены, ведут сбор фракций определенного объема.
Особенности ВЭЖХ
Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование сорбентов с размером зерен 3—10 мкм, что обеспечивает быстрый массоперенос при очень высокой эффективности разделения.
Т.к. колонки наполняют носителем с очень малым диаметром частиц, создается высокое давление, чтобы обеспечить подходящую скорость растворителя для быстрого разделения пробы.
Детекторы, применяемые в ВЭЖХ, чувствительны к флуктуации потока и давления элюента (шумы). Более того, при применении концентрационных детекторов необходима еще более высокая стабильность объемной скорости элюента.
КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ВЭЖХ ПО МЕХАНИЗМУ РАЗДЕЛЕНИЯ
Большинство проводимых методом ВЭЖХ разделений основано на смешанном механизме взаимодействия веществ с сорбентом, обеспечивающим большее или меньшее удерживание компонентов в колонке.
Адсорбционная хроматография - осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими, как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия как с растворителем, так и с адсорбентом.
Распределительная хроматография — это вариант ВЭЖХ, в котором разделение смеси на компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами: растворителем (подвижная фаза) и фазой на сорбенте (неподвижная фаза).
В ионообменной хроматографии разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием способных к ионному обмену противоионов. Ион введенного образца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обменивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство к фиксированным зарядам, разделяются на анионитах или на катионитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты соответственно содержат группы с -отрицательным зарядом, взаимодействующие с катионами.
В качестве подвижной фазы используют водные растворы солей кислот, оснований и растворители имеющих высокое значение диэлектрической проницаемости и большую тенденцию ионизировать соединения.
Эксклюзионная хроматография представляет собой вариант ЖХ, в котором разделение происходит засчет распределения молекул между растворителем, находящимся внутри пор сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами.
В отличие от остальных вариантов ВЭЖХ, где разделение идет за счет различного взаимодействия компонентов с поверхностью сорбента, роль твердого наполнителя в эксклюзионной хроматографии заключается только в формировании пор определенного размера, а неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры. Поэтому применение термина «сорбент» к данным наполнителям в определенной степени условно.
Принципиальной особенностью метода является возможность разделения молекул по их размеру в растворе в диапазоне практически любых молекулярных масс — от 102 до 108, что делает его незаменимым для исследования синтетических и биополимеров.
Аппаратура для жидкостной хроматографии
В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем, до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами.
1 – растворитель (ПФ)
2 – насос
3 - инжектор
4 – колонка
5- термостат
6 – детектор
7 – регистрирующая система
Колонки
Колонки для ВЭЖХ представляют собой толстостенные трубки из нержавеющей стали, способные выдержать высокое давление.
Конструкционно колонка состоит из обязательных частей: трубки и адапторов, и не обязательных частей: рубашки термостата, гидравлической системы для упаковки колонки.
Неразборные колонки
Данный тип колонок в основном используется в аналитической ВЭЖХ, так как данный метод в основном используется для качественного и количественного анализа, при котором особенно важна воспроизводимость результатов. Конструктивно данные колонки представляют собой трубки из не подверженных коррозии сплавов или пластика в которые запрессован сорбент. С двух сторон колонки имеют резьбовые отверстия с коническим углублением для фитингов. Внутренний диаметр от 1 до 10 мм, длина 10-400 мм.
Разборные колонки
Колонки данного типа разбираются на составные части: на трубку и адапторы. Это свойство позволяет самостоятельно заполнять колонки необходимым сорбентом. В ВЭЖХ данный вид колонок применяется в высокопроизводительных хроматографах (препаративных и промышленных). Адапторы бывают подвижные и не подвижные, и колонки, в зависимости от исполнения бывают с двумя неподвижными адапторами, с одним подвижным и одним неподвижным адапторам и с двумя подвижными адапторами.
Адапторы Для удержания сорбента, поддержания постоянного внутреннего объема и создания равномерного и ламинарного потока подвижной фазы через все поперечное сечение колонки используются адапторы.
Подвижные адапторы используются для регулирования внутреннего объема колонки.