4. Промышленное применение технологии периодической ферментации с добавлением источников питания, на примере получения лимонной кислоты

Стадия ферментации - центральная среди этапов промышленного производства. Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную среду инокулята до завершения процессов роста, биосинтеза или биотрансформации.[1]

На современных заводах принято глубинное культивирование гриба, характеризующее более высокой продуктивностью. При этом инокулированная среда наливается хорошо аэрируемые ферментеры с перемешиванием и контролем аэрации. Глубинная ферментация возможна в разных вариантах: периодическом с подпиткой и непрерывном.

Процесс получения лимонной кислоты при глубинном культивировании гриба Aspergillus niger проводят в ферментаторах объемом 100м³. В качестве посевного материала используют подросший мицелий, полученный в посевных аппаратах объемом 10 м³.

Для производственного ферментатора раствор мелассы разбавляют кипящей водой в соотношении 1:1 и, добавляя серную кислоту, доводят рН раствора до значения 6,7 - 7,2. Для осаждения солей железа и тяжелых металлов водят при кипячении определенное количество раствора желтой кровяной соли. В раствор мелассы при температуре 60 - 70⁰С последовательно добавляют источники азота, фосфора, макро- и микроэлементов. Содержание сахаров в среде должно быть не более 4%. По ходу ферментации, когда концентрация сахара резко снижается, проводят дробное добавление стерильного мелассного раствора, содержащего 25 - 28% сахаров. Добавляют этот раствор в таком количестве, чтобы концентрация сахаров в ферментаторе составляла 12 - 15%.

В посевной аппарат, заполненный питательной средой, засевают суспензию конидий, которую предварительно выдерживают 5 - 6 часов в термостате при 32 ⁰С. Культуру выращивают при 34 - 35 ⁰С при постоянном перемешивании и аэрации. В процессе культивирования строго контролируют режим подачи воздуха в ферментатор, расход которого увеличивают к концу ферментации почти в 10 раз. Кислород должен находиться, как минимум в концентрации 20 - 25% от насыщения. В период интенсивного вспенивания среды небольшими порциями вводят химический пеногаситель (олеиновую кислоту). Процесс подращивания мицелия закан-чивают через 30--36 ч, когда содержание кислот в культураль-ной жидкости достигает 1--2%. Подросший мицелий передают для засева питательной среды в производственный ферментатор.

Процесс кислотообразования в ферментаторе продолжается 5--7 суток при непрерывной аэрации и температуре 31--32 ⁰С. Расход воздуха постепенно увеличивают с 400 м³/ч в начале процесса до 2200 м³/ч к концу ферментации. Дробную добавку подливного раствора проводят 2--3 раза, поддерживая концентрацию сахаров, в растворе в пределах 12--15%. Конец процесса определяют по общей кислотности и концентрации сахаров.

После окончания процесса ферментации культуральную жид-кость нагревают острым паром до 60--65 ⁰С и сливают в сбор-ник, а оттуда подают на вакуум-фильтр для отделения и про-мывки биомассы мицелия. Промытый мицелий используется как корм для скота. Основной раствор лимонной кислоты вместе с промывными водами передается в химический цех для вы-деления лимонной кислоты.

Отъемно-долевной способ ферментации заключается в том, что при активно протекающем процессе продолжают подливать мелассную среду с соответствующими предварительными отъемами жидкости. В начале ферментацию ведут по режиму, обычно для периодического способа, затем в 3 - 4 приема или непрерывно подливают дополнительное количество среды. Подлив прекращают за 36 часов до конца процесса ферментации, продолжающийся 12 суток. Суммарное количество сахара за цикл составляет около 30% в пересчете на исходный объем (при начальной 3%-ной концентрации). В период дополнительных подливов поддерживают 1,2 - 1,5%-ную концентрацию сахара. Перед каждым подливом добавляют столько воды, сколько ее увлечено отработавшим сжатым воздухом, и небольшого количества азота.

При ферментации отъемно-долевным способом увеличивается среднесуточный съем лимонной кислоты с 1 м³ферментатора за счет уменьшения частоты его зарядок при том же выходе кислоты по массе сахара.

Непрерывный способ ферментации. Сотрудниками Ленинградского завода лимонной кислоты испытан способ непрерывной ферментации в одном аппарате. Когда концентрация сахара в культуральной жидкости в условиях, характерных для периодического способа, понизится до 0,2 - 0,5%, приступают к непрерывной подаче мелассной среды концентрацией 20 - 25% по сахару в таком количестве, чтобы концентрация сахара постоянно находилась в пределах 0,2 - 0,5% и культуральная жидкость непрерывно отбиралась.

Отмечено, что в процессе непрерывной ферментации A.niger изменяет морфологию и проявляет большую кислотообразующую способность, что и в периодическом. Недостатком непрерывной ферментации в одном аппарате является проскок неферментированного сахара и невозможность осуществления профилактической стерилизации без прерывания процесса. Проведение ферментации в нескольких последовательно соединенных аппаратах не имеет этих недостатков и более перспективно, о чем свидетельствует опыт непрерывного спиртового брожения.[4]

Заключение

конецформыначалоформыЛюди выступали в роли биотехнологов тысячи лет: пекли хлеб, варили пиво, делали сыр, другие молочнокислые продукты, используя различные микроорганизмы и даже не подозревая об их существовании. Не менее древними биотехнологическими процессами являются виноделие, хлебопечение и получение молочнокислых продуктов.[1]

Термин «периодическая культура с добавлением источников питания» ввели Иошида и др. для обозначения периодической культуры, в которую непрерывно добавляется питательная среда [25].

Простое периодическое культивирование характеризуется ростом клеток без подачи дополнительных порций субстрата после посева культуры. Лимит субстрата или образование токсичных компонентов могут привести к снижению продуктивности процесса. Для предотвращения негативных последствий лимита субстрата применяется техника культивирования с подпиткой, при этом субстрат или другие необходимые компоненты добавляются либо непрерывно, либо по сигналу от какого-либо датчика [26].

Периодическая культура с добавлением источников питания развивалась эмпирически для некоторых производственных ферментационных процессов, таких, как получение пенициллина, пекарских дрожжей и удаление отходов путем ферментации.

Для оптимизации выхода продуктов, выделяемых в среду, важно усилить биосинтетическую способность клеток бактерий, а метод культивирования с подпиткой позволяет продлить вторую фазу роста и повысить выход внеклеточных метаболитов. Ограничение скорости поглощения субстрата скоростью его доставки оказывается способом преодоления «катаболитной репрессии» образования продукта. При производстве пекарских дрожжей потребление кислорода регулируется скоростью добавления сахара.

Метод периодических культур с подпиткой использовали при культивировании нетоксикогенного штамма гриба Aspergillus niger для получения лимонной кислоты из углеводосодержащего сырья в результате микробиологического синтеза (ферментации). Культура с подпиткой оказалась наиболее эффективным путём для достижения высокой плотности клеток и высокой продуктивности.

конецформыначалоформыПрименение находят и побочные продукты ферментации: мицелий грибов и культуральная жидкость. Мицелий высушивают и используют как сырье или добавляют к удобрениям. В культуральной жидкости обнаружены гидролитические ферменты пектиназа, протеаза, целюлаза и в-глюкозидаза.

Периодическая культура с добавлением источников питания, кроме того, моделирует некоторые природные микробные системы, как, например, инфекцию мочевых путей. Теория такой культуры показывает, что она должна иметь важное и уникальное применение в управлении ферментационными процессами [25].

Список используемой литературы

1. http://bio-technology.nm.ru

2. http://citricacid.ru/fermentation/deep/

3. Егорова Т. А. Основы биотехнологии.-М.: Издательский центр «Академия», 2006.-208 с

4. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках.- М.: Высш. шк.,1986.-448сконецформыначалоформы

5. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - М.: Мир. 1978.-331с