4.Нормобластоз

5. Морфологические особенности эритроцитов периферической крови в норме и патологии

(см пункт 1,2,3)

6.Цитохимические исследования эритроцитов в клинике.

Сидеробласты и сидероциты - это нормобласты (эритробласты ) и эритроциты, содержащие в цитоплазме негемоглобиновое 2х , 3х валентное железо в виде гранул, окрашиваемых в реакции с берлинской лазурью. Если гранулы свободного железа многочисленные, грубые и располагаются вокруг ядра, образуя кольцо, то такие клетки называются «кольцевидными сидеробластами».

Кольцевые сидеробласт Сидероцит

ПРИНЦИП МЕТОДА.

Использование реакции с берлинской лазурью, основанное на образовании ферриферроцианида при взаимодействие ионов трехвалентного железа с ферроцианидом в кислой среде. Реакция проявляется в виде образования синего или зеленого осадка ферриферроцианида.

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ:

Содержание сидероцитов в периферической крови не превышает 1,1 % (среднее 0,60 ± 0,04%)

В костном мозге- 0,2-2,1 % (среднее 0,90- 0,09 %).

Содержание сидеробластов в костном мозге составляет 23,7±2,4%.

Истощение запасов железа происходит при железодефицитной анемии и сопровождается снижением количества сидеробластов. Избыточное накопление наблюдается при идиопатическом и приобретенном гемохроматозе, хронической гемолитической анемии, талассемии и МДС, что приводит к увеличению числа сидеробластов. При диагностике МДС отличительным признаком РАКС (рефрактерной анемии с кольцевидными сидеробластами) является присутствие в костном мозге более 15 % кольцевидных сидеробластов.

Пробы на ферментопатию эритроцитов

В эритроцитах протекают различные метаболические процессы: гликолиз, пентозофосфатный путь окисления глюкозы, восстановление глутатиона, разрушение перекиси водорода и другие реакции метаболизма. Нарушения этих процессов могут быть связаны с наследственными дефектами синтеза ферментов (энзимопатии).

Наиболее распространенной ферментопатией эритроцитов является нарушение синтеза глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г-6-ФДГ) — ключевого фермента пентозофосфатного пути окисления глюкозы. Существует обратное соотношение между активностью Г-6-ФДГ и резистентностью эритроцитов, поэтому дефицит Г-6-ФДГ в клетке может приводить к гемолизу эритроцитов (гемолитический криз) при приеме пациентами ряда препаратов, действующих как оксиданты, — противомаллярийных средств (примахин), ацетилсалициловой кислоты, сульфаниламидов, нитрофуранов, 5-НОК, ПАСК, фенацитина и др. Для диагностики дефицита Г-6-ФДГ применяются как качественные методики, так и количественны определения ее активности в эритроцитах.

Тест на образование телец Гейнца-Эрлиха по Дейчи.

Принцип. Появление в большом количестве окрашенных телец в патологических эритроцитах при их инкубации с метиловым фиолетовым.

Реактив. 0,5%-ный раствор метилового фиолетового в изотоническом растворе натрия хлорида. Ход исследования. В пробирке смешивают равные количества крови и раствора метилового фиолетового и оставляют на 10 минут. На предметном стекле готовят мазки, накрывают их покровным стеклом и микроскопируют с иммерсионным объективом.

Нормальные величины. У здоровых людей в эритроцитах наблюдается образование единичных телец красного цвета. Небольшое количество телец Гейнца обнаруживают в клетках новорожденных или больных после спленэктомии.

Клиническое значение. В эритроцитах с дефицитом Г-6-ФДГ обнаруживается 4–6 телец. Проба неспецифична, поскольку тельца Гейнца появляются в эритроцитах при передозировке сульфаниламидных препаратов, отравлениях анилиновыми красителями, дефиците других ферментов (глутатион-редуктазы, 6–фосфоглюконатдегидрогеназы), у носителей нестабильных гемоглобинов.

Качественная методика Мотульского-Кемпбеля. Принцип. Г-6-ФДГ является НАДФ-зависимым ферментом в первой реакции окислительной фазы пентозофосфатного пути окисления глюкозы. При ее участии образуется НАДФН, который восстанавливает (обесцвечивает) бриллиантовый крезиловый синий.

Реактивы.

Раствор натриевой соли глюкозо-6-фосфата: (825 мг в 100 мл дистиллированной воды).

Раствор НАДФ: 50 мг в 100 мл дистиллированной воды.

Раствор бриллиантового крезилового синего: 32 мг в 100 мл дистиллированной воды.

Трис-HCl-буфер с pH 8,5: 8,96 г трис (оксиметил) аминометана, 97 мл дистиллированной воды, 3 мл концентрированной соляной кислоты.

Парафин.

Ход исследования. В пробирку вносят 0,1 мл реактива 1, 0,1 мл реактива 2, 0,25 мл реактива 3, 0,2 мл реактива 4, перемешивают. В другую пробирку, куда предварительно налит 1 мл дистиллированной воды, вносят 0,02 мл крови из пальца (при анемии берут 0,04–0,06 мл). Смешивают содержимое обеих пробирок, смесь заливают 1–2 мл жидкого парафина и ставят на водяную баню при 37°С.

Нормальные величины. У здоровых людей смесь обесцвечивается через 40–55 минут.

Клиническое значение. Замедление времени обесцвечивания смеси более 90 минут свидетельствует о дефиците в эритроцитах Г-6-ФДГ. При гемолитической энзимодефицитной анемии обесцвечивание наступает через 3–24 часов.

Качественная методика по Бернштейну. Принцип. В присутствии Г-6-ФДГ образуется НАДФН, который обесцвечивает дихлорфенилиндофенол.

Реактивы.Раствор 2,6-дихлорфенилиндофенола: 14,5 мг в 100 мл трис-HCl-буферного раствора с pH 8,0. Буферный раствор состоит из 1,48 М раствора трис (оксиметил) аминометана (43,27 г в 250 мл дистиллированной воды) и 1,48 М раствора соляной кислоты (2 ампулы фиксанала, содержащего 0,1 моль-экв. HCl, доводят дистиллированной водой до 460 мл. Раствор феназинметасульфата: 2 мл в 100 мл дистиллированной воды.

Раствор НАДФ: 2,3 мл в 1 мг дистиллированной воды.

Раствор глюкозо-6-фосфата: 15,2 мг натриевой соли Г-6-Ф в 1 мл дистиллированной воды. Из этих растворов готовят смесь реактивов: реактив 1 — 16 частей, реактив 2 — 2 части, реактив 3 — 1 часть и реактив 4 — 1 часть.

Ход исследования. В пробирку с 1 мл дистиллированной воды вносят 0,02 мл крови из пальца. После наступления гемолиза добавляют 0,5 мл смеси реактивов, оставляют при комнатной температуре на 15–20 минут, после чего оценивают изменение окраски.

Нормальные величины. У здоровых людей обесцвечивание смеси происходит через 15–20 минут.

Клиническое значение. Удлинение времени обесцвечивания свидетельствует о дефиците в эритроцитах Г-6-ФДГ. Неполное обесцвечивание за 30 минут соответствует незначительному уменьшению активности фермента, а отсутствие обесцвечивания к этому времени — резкому ее снижению.

Тест Клейхауэра-Бетке: Показан при подозрении на фетоматеринскую трансфузию.Тест позволяет выявить в материнской крови эритроциты плода с помощью техники отмывания на предметном стекле. Мазок материнской крови фиксируют и инкубируют в кислотном буфере. При этом гемоглобин взрослого вымывается из эритроцитов. Фетальный же гемоглобин устойчив к вымыванию. После окрашивания мазка клетки с фетальным гемоглобином выглядят темными. а материнские эритроциты - прозрачными. Наличие клеток плода говорит о фетоматеринской трансфузии.