Гель электрофорез в присутствии sds

Внимание! Работу с акриламидом проводят под тягой, в перчатках!

Исходные растворы:

1. Раствор мономеров:

а) акриламид 7.5 г

б) метилен-бис-акриламид 0,2 г

в) додецилсульфат натрия (SDS) 0.025 г

г) вода дистиллированная 20.0 мл

Конечный объем раствора мономеров 25.0 мл

2. Буфер разделительного геля:

а) Трис-(гидроксиметил)аминометан 6.8 г

б) SDS 0.05 г

в) вода дистиллированная 40.0 мл

г) HCl до рН 8.8

Конечный объем буфера разделительного геля 50.0 мл.

3. Буфер фокусирующего (концентрирующего геля) геля:

а) Трис 0.42 г

б) SDS 0.025 г

в) вода дистиллированная 20.0 мл

г) HCl до рН 6.8

Конечный объем буфера фокусирующего геля 25.0 мл

4. Электродный буфер:

а) глицин 14.4 г

б) SDS 1 г

в) вода дистиллированная 900.0 мл

г) Трис 1М до рН 8.3

Конечный объем электродного буфера 1000.0 мл

5. Персульфат аммония (NH₄)₂S₂O₈. Хранение в холодильнике при + 4^оС.

6. ТЕМЕД-реактив стабилен при хранении в холодильнике в неразбавленном виде.

7. Трихлоруксусная кислота (ТХУ) -10%.

8. Отмывочная смесь- этанол : Н₂О : уксусная кислота = 5:5:1

9. Уксусная кислота - 7%.

10. Кумасси G-250 – 40 мг на 100 мл 3.5 % раствора НСlО₄. Растворение красителя проводят на магнитной мешалке 30 мин, после чего обязательно фильтруют через бумажный фильтр.

11. Набор белков маркеров с известной молекулярной массой. В качестве белков белков маркеров используем следующие белки:

а) альбумин бычий 67000 Да.

б) миоглобин 17000 Да.

в) альбумин яичный 45000 Да.

г) цитохром С 12000 Да.

д) смесь.

Прибор

Подготовка образцов

Растворы опытных образцов берут в расчете, что нагрузка на одну трубочку составляет от 10 до 200 мкг по белку. Оптимальная концентрация – 150 мкг по белку. Смесь, состоящую из:

0.100 мл исследуемого раствора

0.04 мл диссационной смеси – 10 % раствор SDS в 25 % -меркаптоэтаноле.

0.03 мл БФГ.

0.03 мл глицерина

выдерживают 2 мин на водяной бане при температуре 100^оС.

Если опытные или стандартные образцы находятся в растворах, содержащих ионы К⁺ или NH₄⁺, перед обработкой SDS их нужно обессолить диализом или гель-хроматографией, так как додецилсульфат калия и аммония плохо растворимы в воде.

Проведение электрофореза

Для проведения электрофореза используют прибор, состоящий из двух резервуаров для буферных растворов. В центре резервуаров находятся электроды. В дне верхнего резервуара имеются отверстия для стеклянных трубочек. Для полимеризации геля тщательно вымытые трубочки, снизу закрытые, фиксируют на специальной подставке из оргстекла.

Для полимеризации разделительного геля (25 %) смешивают 6 мл раствора акриламида и 8 мл буфера разделительного геля. После деаэрирования (5-10 мин) к смеси добавляют 3.5 мг (20 мкл) персульфата аммония и 25 мкл ТЕМЕДа. Смешивания проводят на холоду. Затем пипеткой наливают в трубочки, укрепленные на подставке, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не попали внутрь полимеризуемого геля. Уровень вносимой жидкости должен находиться на расстоянии 1 - 1.5 см от верхнего края трубочки. Сверху осторожно наслаивают воду (0.2-0.3 мл) для образования ровной поверхности геля. Полимеризация обычно заканчивается через час, что определяют по образованию хорошо видимой границы между гелем и водой.

По окончании полимеризации наслоенную воду удаляют фильтровальной бумагой.

Готовят смесь для концентрирующего геля (3 %). Смешивают 0.5 мл раствора акриламида и 4.5 мл буфера фокусирующего геля. Раствор деаэрируют под вакуумом и добавляют 1.5 мг (25 мкл) персульфата аммония и 20.0 мкл ТЕМЕДа. Смешивание проводят на холоду. Затем наливают пипеткой в трубочки. Высота концентрирующего геля 1 см. Сверху осторожно наслаивают дистиллированную воду для образования ровной поверхности геля. Полимеризация идет один час, что определяют по хорошо видимой границе междлу гелем и водой. По окончании полимеризации наслоенную воду удаляют фильтровальной бумагой.

Затем трубочки помещают в прибор для электрофореза, нижний резервуар которого заполнен электродным буфером до отметки, что обеспечивает погружение в буфер на 2-3 см нижней части колонок и нижнего электрода.

На поверхность полиакриламидного геля микропипеткой вносят образцы исследуемых белков и белков маркеров в объеме от 20-100 мкл (каждого или смеси нескольких образцов), содержащих 150-200 мкг белка добавляют 0.1 мл красителя бромфенолового синего в качестве индикаторной краски, по движению которой контролируют ход электрофореза. Колонки осторожно заполняют доверху электродным буфером, затем заливают буфер в верхний резервуар.

Аппарат для электрофореза подключают к соответствующим полюсам источника постоянного тока. Вначале устанавливают силу тока 2 мА на трубочку, силу тока увеличивают до 4 мА на трубочку после того, как образцы войдут в разделительный гель.

Электрофорез завершен, когда зона индикаторной краски окажется на расстоянии 4-6 мм от нижнего конца колонки. этот момент в разных колонках может наступить в разное время, и поэтому для проведения точных, сопоставимых исследований колонки, где электрофорез завершен, изымают из блока, доведя процесс в остальных до конца.

Во время снятия колонки прибор отключают. Электрофорез идет 4-5 часов.

После завершения электрофореза прибор отключают от источника тока, сливают буферный раствор, трубочки вынимают из прибора и с помощью стальной иглы или водой, вводимой шприцом между поверхностью геля и стенкой трубочки, выталкивают столбик геля в пробирки с 10% ТХУ, предварительно пометив фронт красителя тонкой проволокой. Фиксацию в 10% ТХУ проводят 30 мин. После чего гели промывают несколько раз смесью - этанол : дист. вода : уксусная кислота = 5:5:1.

Окрашивание гелей проводят красителем кумасси G-250 3 часа при комнатной температуре. После окрашивания избыток красителя отмывают 7 % раствором уксусной кислоты, цилиндрики геля сохраняют в том же растворе.

Рис. Электрофорез в трубочках.

Таблица

№ пробирки	Белки маркеры	Молекулярная масса, Да
6	альбумин бычий	67000
7	миоглобин	17000
8	альбумин яичный	45000
9	цитохром С	12000
10	смесь	