Гель электрофорез

Лучшего разделения, в частности, белков и нуклеиновых кислот, можно достигнуть, если в качестве носителя использовать гели крахмала, полиакриламида, акриламида.

В настоящее время крахмальный гель используют редко, поскольку более удобным оказался полиакриламидный гель. При использовании полиакриламидного геля можно контролировать эффект молекулярного сита с помощью изменения концентрации геля, а адсорбция белков в нем весьма мала. Полиакриламид - наиболее эффективный носитель для электрофореза белков. Полиакриламидный гель получается при сшивании акриламида N,N'-метилен-бис-акриламидом непосредственно в контейнере, предназначенном для проведения электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле проводят или в колонках с гелем, или на пластинках с геля.

Электрофорез в полиакриламидном геле, вероятно является наиболее гибкой и используемой электрофоретической системой для анализа и разделения молекул.

SDS -гель электрофорез

Клаус Вебер и Мери Осборн показали, что молекулярная масса многих белков можно определить с помощью измерения их подвижности в полиакриламидном геле, содержащем детергент - додецилсульфат натрия (SDS). Белки, обработанные SDS и 0,1 М меркаптоэтанолом, имеют одну и ту же форму и одинаковые отношения заряд/масса. Таким образом достигается зависимость подвижности только от молекулярной массы за счет свойств геля быть молекулярным ситом. Следовательно, если белок с неизвестной молекулярной массой подвергнуть электрофорезу с двумя белками известной молекулярной массы, неизвестная молекулярная масса может быть рассчитана с точностью от 5 до 10 %. Большая точность получается, когда неизвестная молекулярная масса находится между известными массами.

Диск электрофорез в полиакриламидном геле

Метод состоит в том, что тонкий первоначальный слой образца (1-2 мм) концентрируется в сверхтонкую стартовую зону толщиной от 1 до 100 мкм. Заметим, что находится в вертикальной колонке и представляет собой три отдельные области: верхнюю, или область образца, среднюю, называемую прокладкой, и нижнюю, состоящую из собственно разделяющего геля. Область образца и гель-прокладка имеет меньшую концентрацию (больший размер пор), чем разделяющий гель, и готовятся в буфере с низкой ионной силой и различными значениями рН. Больший размер пор верхних слоев геля означает, что молекулы в них задерживаются меньше, двигаясь при этом быстрее, чем в нижнем геле. Быстрое движение через верхние слои геля приводят к накоплению вещества на границе между прокладкой и разделяющим гелем. При движении молекул через разделяющий гель образуются различные зоны в соответствии с подвижностями. После окончания разделения гель удаляют из стеклянной трубочки. Для идентификации зон существует ряд методов. Гель можно окрашивать путем погружения в раствор красителя с последующим тщательным промыванием для удаления не связанного красителя. При необходимости гель можно фотографировать.

Диск-электрофорез применяют в основном для определения чистоты предположительно чистых белков и для анализа компонентов смесей, когда необходимо получить очень высокое разрешение (т.е. в случае присутствия очень большого количества компонентов).