Лабораторная работа № 1 по теме: «Электрофорез»

Выполнили: студентки 4 курса 18 группы

Богачевская А., Добрыгина О., Иксанова М.¸ Коско Е.

Цель работы: ознакомление с методом электрофореза; проведение электрофореза в трубочках.

Электрофорез

Большинство биологических полимеров содержат заряженные группы, поэтому они способны двигаться в электрическом поле. Движение частиц в растворителе под влиянием электрического поля называется электрофорезом.

Скорость перемещения макромолекул в электрическом поле служит их полезным характеристикой. Это свойство можно использовать для определения молекулярной массы белков, для разделения смесей белков.

Существует три типа электрофореза: с подвижной границей, зональный и непрерывный.

Метод электрофореза с подвижной границей является аналитическим методом, использующимся в первую очередь для определения подвижности и изоэлектрических точек белков, однако, в связи с тем, что здесь обычно трудно количественно определить подвижности, этот метод используется сравнительно редко.

В зональном электрофорезе пятно или тонкий слой раствора, нанесенного на полутвердый или гелеобразный материал, помещают в электрическое поле, в результате чего молекулы перемещаются по или через материал носителя. Поскольку образец наносится в виде зоны, для полноты разделения приходится использовать небольшие количества вещества. Метод используется для анализа смесей, определения чистоты, а также очистки.

Электрофорез на бумаге

Полоску бумаги сначала погружают в буферный раствор, а затем помещают в камеру. Далее образец наносят либо в виде пятна, либо в виде линии. После окончания разделения бумагу вынимают и высушивают. Если образец содержит достаточное количество вещества, оно может быть обнаружено по его окраске, по флуоресценции или при окрашивании различными красителями. Если требуется количественное определение, вещество можно элюировать и определить спектрофотометрически. Так как элюирование красителя редко бывает количественным, точность такого определения составляет около 20 %. Низковольтный электрофорез мало эффективен для небольших молекул (например, аминокислот и нуклеотидов), поскольку из-за малого заряда они обладают низкой подвижностью и следовательно, медленно делятся.

В высоковольтном электрофорезе скорость разделения увеличивается за счет использования градиента потенциала 200 В/см. Высокое напряжение обуславливает большую силу тока, бумага нагревается, поэтому здесь необходимо охлаждение. Для охлаждения бумагу погружают в большой объем несмешивающейся и не проводящей ток жидкости или прижимают ее к охлаждающей поверхности. Метод погружения используется редко, поскольку применяемые охлаждающие жидкости (например, толуол, четыреххлористый углерод или различные масла) являются токсичными. Метод закрытой бумаги находит более широкое применение. В данном случае бумага не погружается в буфер. После окончания электрофореза бумагу высушивают, а вещества определяют также как и при низковольтном электрофорезе.

Высоковольтный электрофорез на бумаге имеет большую ценность для разделения аминокислот и пептидов. Поскольку полное разделение смесей не всегда возможно при использовании одного высоковольтного электрофореза, его часто используют в сочетании с хроматографией; этот метод известен под названием двумерного разделения. Образец вначале подвергают электрофорезу, а затем хроматографируют под прямым углом или наоборот.