Генная инженерия
Основа современной биотехнологии;
- прикладная молекулярная и клеточная генетика, связанная с созданием in Vitro новых комбинаций генетического материала, способных размножаться в клетке – хозяина и синтезировать конечный продукт обмена.
- наука о генетическом конструировании, направленная на создание новых, форм DNK клетки и целых организмов с помощью приемов искусственного перемещения генов.
Молекулярно – биологическая (генная) инженерия возникла в 1961г. в лаборатории Берга в США Станфордском Университете. Получена 1-ая гибридная DNK, в которой были соединены фрагменты лямбда – фага кишечной и вируса обезьян SV – 40.
Получение рекомбинантных молекул dnk
1. получение автономно удваивающейся структуры – вектора и фрагмента DNK, подлежащего выделению. Вектор нужен для включения исключительно создавшихся структур в хромосоме хозяина. Векторы созданные на основе бактериальных плазмид, фагов и Vir животных. Они сообщают гибридным молекулам способность воспроизводить в клетке – хозяина (чаще бактерии) не зависимо от хромосомы. Вместе с вектором проникает в клетку хозяина связанная с ним чужеродным DNK. Иногда вектор называют «повозкой» - плазмида – переносчик. Затем получают 2-й компонент гибридных молекул, ради которой все делается – фрагмент DNK чужеродный по отношению к вектору, содержащий нужные гены и подлежащий в дальнейшем селекции и размножению.
Инструментом для получения нужных фрагментов DNK служит фермент рестриктаза (реструкционнвая эндонуклеаза) – разновдность дезоксирибонуклеаз, ферментов, разрезающих DNK в определенном месте с симметричной последовательностью нуклеотидов. Некоторые рестриктазы образуют липкие концы, которыми склеивается плазмида. in Vitro.
2. Ковалентное сшивание фрагмента, с добавлением лигазы – фермент, сшивающий свободные концы DNK и плазмиды между собой, участвует в репарации DNK. in Vitro.
3. Введение (трансформация) гибридной молекулы в бактериальную или животную клетку, где они амплифицируются. Обычно берут культуру кишечной палочки (кп), обрабатывают ее СаСl2 при t = +10, иногда с тепловым шоком или берут мутантную линию. Если используется вирус, то этот процесс называется трансфекция.
Зараженные клетки кп высеваются на питательную среду так, чтобы каждую бактерия лежала отдельно и могла образовывать собственную колонию. Бактерии, в которую не попала плазмида не образуют колонию так как в среду для выращивания добавлен амплифицин, от которого плазмида защищает бактерию. Из нужной колонии выращивают чистую линию, заставляют ее работать, пролучая конечный продукт.
Векторы
Их конструируют на основе:
Плазмид
Плазмида кп: детерминация синтеза антибиотиков. Даже когда в среде присутствует антибиотик – хлоран феникол, при этом выключается синтез хромосом кп, то репликация плазмиды продолжается еще 12 часов, увеличивая число плазмид в 1 клетке до 3000.Это делает кп перспективным вектором.
Половой фактор – f плазмида
r плазмида – фактор множественной лекарственной устойчивости: к антибиотикам, стрептомицин, неомицин, хлоран, фипикон. При обработке ее рестриктазой, она распадается на 12 фрагментов, что делает ее непригодной в качестве вектора, но из этих фрагментов получают маленькую плазмидку, способную к репликации.
Векторы на основе фагов и вирусов.
Например на умеренном бактериофаге Лямбда λ – присутствует в клетке в виде профага, передается по наследству, при определенных условиях может мутировать в клетке. При гибридизации жизнеспособные частицы фага получают, если используют его мутанта с делециями до 30%. Важно, чтоб делеции не затрагивали те участки фага, которые ответственны за размножение вибрионов.
Попытки использования в качестве векторов митохондриальнную DNK и хлоропластов пока были неудачны.