Инструкция к практическому занятию №14 тема: «Микробиологическая диагностика дифтерии. Специфическая профилактика дифтерии»

Задачи:

• Изучить методы выявления палочки Леффлера.

• Специфическая профилактика дифтерии.

• Изучить правила забора материала на бактерию Леффлера

• Изучить правила введения сыворотки по методу Безредке

ЗАДАНИЕ №1

1.1. Изучите методы выявления палочки Леффлера

Дифтерия – острая инфекция дыхательных путей, сопровождающаяся тяжелой интоксикацией, образованием в зеве дифтеритической пленки, резким отеком гортани, затруднением дыхания и асфиксией.

При заболеваниях, вызванных коринебактериями дифтерии в лабораторию доставляется следующий материал: отделяемое носоглотки, налет из очага воспаления при дифтерии (материал собирается двумя стерильными тампонами. Один из них используется для приготовления мазков, другой – для засева на среды).

Основной этап:

1. Бактериоскопическое исследование: Диагностика дифтерии начинается с микроскопии мазков. Обычно делают 2-3 мазка. Коринебактерии дифтерии по Граму окрашиваются в фиолетовый цвет, а другие красители воспринимают неравномерно, поэтому под микроскопом они кажутся зебровидными. Непатогенные коринеформы в цветах однотонны, так как не имеют гранул волютина; в мазках они располагаются беспорядочно.

2. Бактериологическое исследование: Посев материала производят на скошенную в пробирке лошадиную сыворотку, в чашку Петри с теллуритовым кровяным агаром (среда Клауберга) и на среду Тинсдаля. Состав среды Клауберга: 100 мл расплавленного и охлажденного до 50⁰ 2-3% агара, 5-10% дефибринированная кровь, 1 мл 2 % раствора теллурита калия (К₂ТеО₄). Среду тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

Состав среды Тинсдаля: 100 мл расплавленного и охлажденного до 50⁰ МПА, 1 % раствор цистина, 0,1 % раствор НCl – 12 мл, 2% раствор теллурита калия, 2,5 % раствор гипосульфита натрия, нормальная лошадиная или бычья сыворотка – 20 мл. Среду перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

Колонии коринебактерии вырастают на свернутой сыворотке через 8-12 часов, имеют желтовато-кремовый оттенок и, что характерно, даже при большом их количестве несклонны к слиянию.

На плотных средах в чашках Петри колонии коринебактерий дифтерии вырастают через 24-48 часов. При этом на теллуритовом кровяном агаре могут формироваться 2 культуральных варианта:

1. Крупные серовато-черные, шероховатые колонии культивара гравис.

2. Мелкие черные колонии культивара митис с гладкой выпуклой поверхностью и ровным краем.

Непатогенные коринебактерии образуют сухие, мелкие колонии серого цвета. На среде Тинстадаля колонии коринебактерий дифтерии окружены темно-коричневым ободком.

Для получения чистой культуры микроскопируют и пересевают на сывороточную среду, а затем идентифицируют (определение цистиназы – проба Пинзу, определение фермента уреазы – проба Закса).

3. Серологическое исследование. Определяют токсигенность, испытывая культуру в реакции преципитации на пластинчатом фосфатно-пептонном агаре, подсевая ее бляшками к расположенной по диаметру чашки полоске фильтровальной бумаги, смоченной антидифтерийной сывороткой. Положительная реакция прямой гемагглютинаци проявляется образованием на границе взаимодействия антитоксина и продуцируемого экзотоксина равномерно сливающихся полос преципитатов.

4. Биологическое исследование. Токсигекнность штаммов коринебактерий дифтерии in vivo определяют на морских свинках. Введенная внутрикожно культура вызывает у них местный некроз, а подкожная инъекция – летальный исход с экссудацией в серозные полости и увеличение надпочечников до размера вишни.