6.3. Селекция мутантов in vitro. Экспрессия мутаций у растений-регенерантов.

Первый этап процедуры выделения мутантов через культуру клеток растений in vitro включает селекцию определенных фенотипических вариантов путем помещения культур после обработки мутагеном (или без обработки) на питательную среду, содержащую селективный агент, или воздействия на культуры селективным фактором среды, например, повышенной/пониженной температурой. К непосредственной селекции клеточных вариантов приступают не сразу после мутагенной обработки, а через определенный промежуток времени (от 2 час до недели), необходимый для экспрессии мутаций. Выбор времени переноса культур на селективную среду зависит от типа мутаций, которые хотят получить, стадии клеточного цикла, количества клеток в исходных колониях и числа делений в предполагаемых мутантных клетках до начала селекции.

Наиболее распространенным методом отбора мутантных клеточных вариантов является прямая (позитивная) селекция. Ее используют для выделения мутантов, устойчивых к различным антиметаболитам: гербицидам, антибиотикам, токсинам. Применяют две основные стратегии прямой селекции: одношаговую (single-step) и многошаговую, или ступенчатую. В первом случае концентрация селективного агента в среде в 2-3 раза превышает концентрацию, при которой наблюдается 100% ингибирование роста и гибель культуры (MIC₁₀₀ – minimum inhibition concentration). В этом случае вероятность выживания неустойчивых клеток минимальна, однако могут погибнуть из-за малочисленности и устойчивые клетки. При ступенчатой селекции концентрацию селективного агента повышают постепенно в ряду последовательных пассажей культуры, начиная с концентрации, при которой наблюдается ингибирование роста приблизительно половины клеток ((MIC₅₀). В результате применения ступенчатой селекции доля в популяции устойчивых клеток увеличивается и к моменту достижения MIC их количество достаточно велико, чтобы поддерживать деления. С помощью прямой селекции выделены представляющие практический интерес мутанты, обладающие устойчивостью к гербицидам, засолению, к некоторым болезням.

Для отбора условно летальных мутантов (ауксотрофных, чувствительных к стрессовым воздействиям) применяют непрямую (негативную) селекцию. Этот метод селекции основан на избирательной гибели под действием селективного фактора делящихся клеток дикого типа и выживании метаболически неактивных мутантных клеток. Например, с целью отбора температурочувствительных клеток культуры помещают в условия повышенной температуры (32^оС), в питательную среду при этом добавляют токсины (например, 5-бромдезоксиуридин, П-фторфенилаланин, арсенат натрия и др.). В таких условиях делящиеся клетки дикого типа погибают, а неактивные мутантные клетки сохраняются. При переносе культур в условия нормальной температуры на среде без токсина выжившие клетки возобновляют деления.

Для отбора ауксотрофов культуры переносят с минимальной среды (с токсином) на обогащенную среду без токсина, то есть дополненную комплексом аминокислот, витаминов или гидролизатом казеина, дрожжевым экстрактом. Пищевую потребность для роста каждой выжившей колонии затем выясняют, помещая их на среды, дополненные определенными добавками: отдельными аминокислотами, витаминами и др.

В некоторых случаях отбор клеточных вариантов можно проводить визуально по внешним признакам, например, по интенсивности их окраски, обусловленной биосинтезом каких-либо пигментов, например, шиконина. Еще один метод – тотальная селекция, которая основана на индивидуальном тестировании отдельных клеточных клонов. Так, если визуальная селекция невозможна, проводят отбор клеточных линий-суперпродуцентов каких-либо вторичных метаболитов по результатам количественного их определения на давленных цитологических препаратах с помощью стандартных гистохимических или других методов (см. главу 4). Основной недостаток тотальной селекции – ее высокая трудоемкость.

Второй этап процедуры выделения мутантов – получение растений-регенерантов из клеточных клонов, отобранных в селективных условиях, их размножение и тестирование. Как отмечалось выше, не все признаки, проявляющиеся на клеточном уровне, могут экспрессироваться на уровне организменном. Кроме того, в ходе отбора клеточных вариантов могут сохраняться клетки дикого типа, что может иметь место, например, при проведении клеточной селекции на каллюсных культурах. Поэтому для того, чтобы гарантировать получение растений с интересующей исследователя мутацией, культуры после проведения клеточной селекции переносят на регенерационные среды, содержащие селективный агент. Селективный агент может присутствовать и в питательных средах, применяемых для укоренения растений-регенерантов, их клонального размножения in vitro.

Пробирочные растения предположительно мутантных клонов могут быть подвергнуты биохимическим, молекулярно-генетическим или другим анализам, необходимым для изучения природы мутационных изменений.

Для подтверждения генетической детерминированности выявленной изменчивости у растений-регенерантов, изучения наследования выделенных мутаций проводят классический генетический анализ, основанный на определении характера расщепления в их половых поколениях (F1, F2) от скрещивания с исходными растениями.