1.3. Генетический аппарат

Генетический аппарат сибиреязвенного микроба состоит из хромосомы и двух плазмид (рХО1 и рХО2), открытых в 80-х годах прошлого столетия. Плазмида рХО1 содержит три токсиновых гена: отечного фактора (cya), протективного антигена (pag) и летального фактора (lef). Имеются также гены регуляров синтеза этих продуктов: положительный регулятор синтеза экзотоксина (atxA), отрицательный регулятор синтеза протективного антигена (pagR) и группа генов, обеспечивающих прорастание спор (ger) (рисунок 1). Плазмида может быть элиминирована из клеток под воздействием температурного фактора, в частности, при культивировании штаммов при 42^O- 43^OС. После попадания возбудителя сибирской язвы в организм человека или животного его факторы патогенности действуют в определенной последовательности и направлены на строго определенные мишени. Споры прорастают и начинают одновременно продуцировать капсулу, защищающую клетки от фагоцитоза, и экзотоксин, воздействующий на макрофаги.

Рисунок 1 – Генетический аппарат возбудителя сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы продуцирует сильный экзотоксин, обусловливающий тяжесть течения болезни. Именно в связи с биологическими свойствами возбудитель сибирской язвы отнесен к группе особо опасных инфекций. Сибиреязвенный экзотоксин представляет собой белковую молекулу, состоящую из трех субъединиц (факторов), эдематозный (отечный) фактор, протективный и летальный фактор. Названия даны по характеру действия на лабораторных животных. Их синтезируют капсульные и бескапсульные варианты микроба. Эдематозный фактор (фактор I) вызывает местную воспалительную реакцию - отек и разрушение тканей. В химическом отношении это - липопротеид. Протективный антиген (фактор II) - носитель защитных свойств, обладает выраженным иммуногенным действием, так как в ответ на его введение образуются антитела, которые предотвращают последующее заражение высоковирулентными штаммами бактерий. В чистом виде нетоксичен, но в смеси с летальным фактором III вызывает гибель крыс, белых мышей и морских свинок. В молекуле токсина протективный антиген играет транспортную роль: сначала соединяется со специфическим клеточным рецептором, потом активируется за счет гидролиза и в результате обретает способность образовывать мембранные каналы, чем и обеспечивает перенос двух других субъединиц – отечного и летального факторов – в клетку организма-хозяина. Там эти токсины и осуществляют свое цитотоксическое действие: вместе с экзопротеазами вызывают резкие нарушения клеточного обмена, приводя к деградации и гибели клетки. Токсин вызывает повреждение сосудов с отеком, гемморагиями и тромбозом в результате повышения под действием токсина проницаемости эндотелиальных клеток.

В плазмиде рХО2 наиболее значимы гены, определяющие синтез капсулы: положительный регулятор синтеза D - глютаминовой кислоты (acpA) и дублированный (atxA), а также ген, ограничивающий полимеризацию капсульной субстанции (dep). Элиминирующим агентом для капсульной рХО2 плазмиды является антибиотик новебиоцин.

Капсула у бациллы возбудителя сибирской язвы обнаружена в 1988 году Serafini. Капсула препятствует фагоцитозу, защищает бациллы от бактерицидного действия жидкостей организма, а также способствует фиксации бациллы на клетках организма, что ведет к резким нарушениям обменных процессов, быстрой их дегенерации и гибели. Капсула состоит из D-глютаминовой кислоты. Капсула сибиреязвенного микроба разрушается в организме естественно резистентных или иммунизированных животных, но сохраняется в организме восприимчивых животных. Синтез капсульного вещества наблюдается не только в макроорганизме, но и в условиях повышенного содержания углекислого газа на сывороточном агаре. В оболочке сибиреязвенного микроба выделяют три антигена: поверхностные антигены капсулы, собственного капсульные антигены и антигены оболочки. Природные или экспериментальные штаммы, потерявшие плазмиду рХО2, но сохранившие плазмиду токсигенности, становятся слабовирулентными, что было подтверждено нами на модели лабораторных животных. По литературным данным в природе встречаются атипичные, акапсулогенные штаммы сибиреязвенного микроба. Как правило, такие штаммы выделяют из почвы сибиреязвенных скотомогильников, однако такие штаммы выделят от людей, больных сибирской язвой. Для практических работников не вызывает затруднений идентификация вирулентных капсульных штаммов: они однотипны независимо от источника выделения, характеризуются лишь небольшими отличиями. Проблему представляет идентификация полевых бескапсульных штаммов, обладающих слабой вирулентностью для мышей, морских свинок, а также дифференциация их от Bacillus cereus, патогенных для людей и лабораторных животных. С этой целью используются методы молекулярной биологии. В качестве дополнительного теста ПЦР анализ включен в общую схему идентификации Bacillus anthracis в лабораторной службе США

Полностью расшифрована нуклеотидная последовательность первой плазмиды и значительная часть второй. Благодаря этому существенно расширились возможности генетических манипуляций с бациллой. В генетическом отношении она оказалась одним из наиболее однородных микроорганизмов, что во многом связано со способностью бациллы образовывать споры. Различия между ее штаммами сводятся к наличию или отсутствию плазмид или вариабельности их структуры. Результаты генетического изучения в различных модификациях ПЦР 100 коллекционных штаммов возбудителя сибирской язвы, выделенных на территории Республики Казахстан во время вспышек и плановых обследований в период с 1952 по 2006 годы позволили определить уровень вирулентности возбудителя сибирской язвы выявлением двух плазмид, несущих генетические детерминанты синтеза токсина (рХО1) и капсулы (рХО2). Результаты исследования показали, что почти все коллекционные штаммы Bacillus anthracis имеют гены pag и cap, кодирующие синтез плазмид рХО1 и рХО2. Проведенные исследования показали высокую чувствительность и специфичность метода ПЦР при идентификации штаммов Bacillus anthracis. Ни в одном случае не было получено ложноположительных результатов c близкородственным штаммом Bacillus сereus. Впервые в Казахстане проведено молекулярное типирование штаммов Bacillus anthracis с использованием метода многолокусного определения вариабельного числа тандемных повторов (VNTR). Данный метод позволяет обнаружить значительное внутривидовое разнообразие генома возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis, до недавнего времени считавшегося мономорфным. Определено, что различие среди штаммов Bacillus anthracis обусловлено существованием в геноме бактерий вариабельного числа тандемных повторов (Variable Number Tandemly Repeats, VNTR). В геномной ДНК содержатся повторяющиеся нуклеотидные последовательности. Причем у разных индивидов (будь то человек или микроб) число этих повторений разное. Кратность повтора определяется количеством повторений нуклеотидной последовательности. Длиной повтора является размер повторяющейся последовательности, а локусом повтора называется участок генома, содержащий тандемный повтор. Например, локус "AATAATAATAAT" содержит тандемный повтор длиной в 3 нуклеотида (AAT), с кратностью повтора 4. Характеристики нескольких локусов одного организма (микроба или человека) называются генотипом. Разработанная на основе 6-и хромосомных и 2-х плазмидных маркеров система анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов позволило определить 89 генотипов Bacillus аnthracis, выделенных в различных географических регионах, объединенных в 6 генетических групп, которые распределяются внутри двух больших филогенетических групп А и В. Группа А представлена штаммами различного географического происхождения, в то время как штаммы группы В выделяются, в основном, в Южной Африке. Изучение генотипов штаммов сибиреязвенного микроба по 6 хромосомным и 2 плазмидным локусам позволило определить, что в очагах сибирской язвы Казахстана циркулируют штаммы Bacillus anthracis 12 генотипов (KZ 1-12), входящие в состав 5 кластеров А1а, А4, А3в, А5, А6 (рисунок 2). Большинство штаммов, циркулирующих на территории Республики Казахстан, имеют признаки характерные для генетической группы «A», которая широко распространена в мире. Подобные штаммы выделены в Китае, Турции, Европе, на западе США, Канаде. Большая часть штаммов - 84,3% относится к генетической группе A1a.

Стабильность генетических признаков штаммов доказывается тем, что в этой группе два штамма возбудителя сибирской язвы были выделены в ЮКО в 1961 году, а три штамма – летом 2000 года. Два штамма, выделенные в ЮКО в 1962 г. из селезенки МРС и в 1981 г. в Атырауской области от верблюда, принадлежат к A4 кластеру. Генетически эти штаммы близки к штаммам Bacillus anthracis, циркулирующим в Пакистане и западной части Китая. Для кластера А4 характерны штаммы Bacillus anthracis, выделяемые из некоторых регионов США, Европы, Норвегии, Азии. В кластер A4 включен штамм Bacillus anthracis Vollum, который используется в научных разработках в военных лабораториях Великобритании.

Штаммы, относящиеся к кластеру А3b, выделены в ВКО в 2004 году. В этот кластер входит значительная группа штаммов Bacillus anthracis, в которой Р. Keim удалось выделить 39 из 89 генотипов. Подобные штаммы были выделены в очагах Крюгеровского национального парка (ЮАР), в Австралии, Турции, Южной Африки. К этой же группе также относятся вакцинные штаммы Bacillus anthracis Sterne и V770-NPR.

Определение тенденции распространения штаммов Bacillus anthracis на изучаемой территории очень важная часть работы, так как дает возможность выявить источник заражения людей и животных, что может способствовать улучшению эпидемиологического мониторинга за этой инфекцией. Методы идентификации и дифференциации бактерий, основанные на изучении структуры генов, являются трудоемкими, но наиболее информативными, когда необходимо определить регион, где имеется источник возбудителя Bacillus anthracis.

Размеры хромосомных маркеров по числу пар нуклеотидов (п.н.)						Размеры плазмидных маркеров по (п.н.)			Генотипы	Число штаммов	Географическое происхождение
vrrA	vrrB1	vrrB2	vrrC1	vrrC2	CG-3	pX01	pX02	Кластеры
313	229	162	613	604	153	132	137	A1a	KZ -1	21	Жамбылская область, ЮКО, ЗКО
313	229	162	613	604	153	135	137	A1a	KZ -2	5	ЮКО, ВКО
313	229	162	613	604	153	129	139	A1a	KZ -3	1	ЮКО
313	229	162	613	604	153	129	137	A1a	KZ -4	17	Жамбылская, Атырауская Кызылординская области, ЮКО, ВКО
313	229	162	613	604	153	138	137	A1a	KZ -5	5	Жамбылская, Алматинская, Кызылординская области
301	229	162	613	604	153	126	137	A1a	KZ -6	2	ВКО
313	229	162	613	604	153	126	137	A1a	KZ -7	15	Жамбылская, Актюбинская области, ЮКО
313	229	162	613	604	153	132	139	A1a	KZ -8	8	ЮКО выделены в 60ые. 50-51 в 2000
325	229	162	613	604	158	132	137	A5	KZ -9	5	ЮКО
313	229	162	538	604	158	126	137	A4	KZ -10	2	Атырауская область, ЮКО,
313	229	162	583	532	153	129	141	A6	KZ -11	1	Штамм из Кыргызстана
313	229	162	583	532	158	126	39	A3b	KZ -12	6	ВКО

Рисунок 2 - Результаты изучения генетической вариабельности коллекционных штаммов Bacillus anthracis по хромосомным и плазмидным локусам