Непрямой метод ифа

Непрямой метод чаще используется для серодиагностики. В таком случае известным компонентом реакции являются антигены, фиксирован­ные на твердой фазе. В лунки вносится исследуемая сыворотка больно­го человека (неизвестные антитела). После инкубации в течение неко­торого времени, позволяющего связаться антигенам со специфическими антителами, проводится отмывка содержимого лунок. Если антигены соответствуют исследуемым антителам, образуется их соединение, и комплекс антиген-антитело оказывается фиксированным к поверхности лунок. Затем в лунки добавляют меченую ферментом антиглобулиновую сыворотку. Эти антитела специфически связываются с белками сыворотки обследуемого человека, так как являются антителами к этим белкам. Образуется так называемый "сэндвич": антигены + антитела сыворотки + антиглобулин, меченый ферментом. После очередной отмывки в лун­ки вносится субстрат, который делает реакцию видимой (изменяется цвет жидкости в лунках). Результаты реакции более точно определяют­ся фотометрически - они оцениваются по интенсивности изменения цвета среды с помощью специальных приборов - фотоколориметров.

3.5.3. Радиоиммунный анализ

В 1960 г. Ялод и Берсон разработали и внедрили в практику метод определения концентрации инсулина в плазме крови человека с использованием радиоактивной метки; он оказался приемлемым для количественного определения и других гормонов.

Эти исследования показали необычайно высокую чувствительность метода, позволяющего выявить незначительные количества инсулина, меченого радиоактивным йодом, по их связыванию с соответствующими антителами.

В дальнейшем предложенный радиоиммунный анализ (РИА) навел широкое применение в иммунологических исследованиях с целью выяв­ления различных по природе антигенов или антител.

Характерной особенностью радиоиммунологическйх методов явля­ется использование антигенов или антител с радиоактивной меткой. Для получения последних радиоактивные изотопы (14с, 125J, Зн, 32р и другие) вводятся в состав антигенов или антител.

На сегодняшний день существует много вариантов постановки реакции с мечеными радиоизотопами антигенами или антителами.

С целью серодиагностики возможно применение прямого варианта РИА.

Aг * I¹³⁵ + Aт →

радиоактивный стандартный исследуемая

диагностикум с известной сыворотка

радиоактивностью (R₁)

Aг * I¹³⁵ ─ Aт + Aг * I¹³⁵

комплекс надосадочная жидкость

с радиоактивностью (R₂)

Образовавшийся комплекс отделяют от оставшегося свободным меченого антигена (R₂). Затем с помощью счетчика определяют радиоактивность несвязавшегося меченого антигена. Если R₁ › R₂, реак­ция считается положительной. Разница R₁ - R₂ указывает на точное количество содержание искомого антитела.

С целью сероидентификации применяют конкурентный РИА. При этом в реакции участвуют стандартный меченый антиген и определяемый немеченый антиген, которые как бы конкурирует за места связывания специфических антител стандартной иммунной сы­воротки до наступления момента достижения равновесия всех компо­нентов реакционной смеси.

Для оценки полученных результатов отде­ляют образовавшиеся комплексы антиген-антитела (фильтрованием, центрифугированием) и с помощью счетчика определяют их радиоак­тивность. Концентрация исследуемого антигена в анализируемых про­бах устанавливается путем вычисления радиоактивности анализируе­мых проб и в контрольных образцах, где используются стандартные антигены и антитела.

1 проба:

Aг * I^{135 +} Aт → Aг * I¹³⁵ ─ Aт

меченый стандартный специфическая комплекс с радио

диагностикум иммунная сыворотка активностью (R₁)

2 проба:

A г + Aт + Aг * I¹³⁵

исследуемый специфическая меченый стандартный

неизвестный диагностическая диагностикум

иммунная сыворотка

Aг ─ Aт ─ Aг * I¹³⁵ + Aг * I¹³⁵

комплекс с радиоактив- свободный, несвязавшийся,

ностью (R₂) отмывается

Образовавшиеся комплексы отделяют от свободного, оставшего­ся несвязанным меченого антигена. Затем с помощью счетчика опре­деляют и сравнивают радиоактивности образовавшихся комплексов R₁ и R₂ .Если R₁ › R₂ - реакция считается положительной. Разница R₁ - R₂ указывает на точное количественное содержание искомого антигена.

Недостатки ИФА - сложности, связанные с получением высокоочищенных антигенов и с необходимостью создания безопасных условий при работе с радиоактивными веществами.