3.5.2. Иммуноферментный анализ

В основу метода положено свойство антител соединяться с фер­ментом. Это соединение не приводит к утрате ни специфичности ан­тител, ни каталитической активности ферментов. Ферментные метки - это белковые молекулы, обладающие чрезвычайно мощным каталити­ческим действием. Ничтожно малые дозы фермента можно выявить и определить их количества по катализируемой ими реакции. В качест­ве ферментных меток наиболее часто используют: пероксидазу, щелочную фосфатазу, глюкозоксидазу. Для их выявления применяют спе­цифические субстраты (для каждого фермента есть свой субстрат). При наличии фермента субстрат изменяет свою окраску, и это регис­трируется визуально или при помощи спектрофотоколориметра. В ка­честве субстратов применяются: перекись водорода, ортодианизидин, паранитрофенилфосфат, паранитэофенил. На сегодняшний день известно большое число вариантов иммуноферментного метода. Наиболее широкое применение на практике на­шел вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Суть его в том, что один из компонентов реакции (антиген или антитело) фиксирован на твердом носителе, к нему последовательно добавляются другие компоненты реакций в жидкой фазе. В качестве твердых носителей используются изготовленные из синтетических инертных материалов (полистирола, дакрила, метакрила, поливинилхлорида и др.) панели, шарики, пробирки. После соединения анти­гена с антителами этот образовавшийся комплекс путем промывания можно легко отделить от несвязавшихся компонентов реакции. Метод основан на последовательном взаимодействии фиксированных на твер­дой фазе антигенов (или антител) со специфическими антителами (антигенами), а затем - и с иммуноферментными конъюгатами, пред­ставляющими собой меченые ферментом антитела против иммуноглобу­линов.

ИФА имеет следующие преимущества перед другими серологическими методами:

1) метод является универсальным, так как позволяет определить любое соединение, против которого получены специфические антите­ла;

2) меченые соединения устойчивы и сохраняют свою специфичес­кую активность при длительном хранении;

3) ИФА отличается высокой чувствительностью и специфичностью;

4) его результаты можно оценивать визуально, без применения специальной аппаратуры.

ИФА применяется для определения как антител, так и антигенов. В зависимости от применяемой модификации ИФА различают следующие варианты методов: прямой, непрямой, конкурентный.

Прямой метод ифа

Данный метод называют еще "сэндвич-методом". Он применяется для сероидентификации. В данном случав известным компонентом реакции, являются антитела, фиксированные на твердой фазе. Вначале в лунки, к поверхности которых фиксированы антитела (антитела-1), добавляют исследуемый антигенсодержащий материал. После опре­деленного инкубирования отмывают содержимое лунок, в результате чего несвязавшийся антиген удаляется. Затем в лунки помещают избы­ток антител, специфичных к данному антигену и меченых ферментом (антитела-2 + фермент), снова отмывают и добавляют субстрат для фермента. По истечении определенного времени останавливают реакцию внесением специфического реагента и учитывают результат визуально или по показаниям спектрофотометра. Если анализируемый антиген ока­жется специфичным по отношению к сорбированным на носителе антите­лам, то произойдет образование комплекса антитела-1 + антиген + антитела-2 + фермент; тот комплекс будет фиксирован на твердой фазе и не удалится при промываниях лунок. Для выявления фермента к сме­си добавляют субстрат, который отщепляет этот фермент, что прояв­ляется изменением окраски реагирующих смесей. Если же анализируемый антиген окажется неспецифичным по отношению к сорбированным на но­сителе антителам, то несвязавшийся антиген и меченые антитела бу­дут удалены из системы во время отмывок, и внесение субстрата не вызовет изменения окраски содержимого лунок пластиковой пластины.