3.5. Реакции с меченными компонентами

3.5.1. Иммунофлюоресцентные методы

В 1950 году Кунс и Каплан доказали возможность ковалентного связывания флюоресцентных красителей со свободными аминогруппами молекул антител. При этом связанные антитела не утрачивают спо­собности реагировать с антигенами.

В основу иммунофлюоресцентного метода положено такое взаимо­действие антигена с антителом, при котором один из компонентов реакции (чаще антитело) ковалентно связан с флюоресцентным красителем (флюорохромом – это краситель, который обладает свойством светиться в ультрофиолетовых лучах). При соединении гомологичных антигенов и антител образуются иммунные комплексы, которые ярко светятся при люминесцентной микроскопии. В качестве флюоресцентных красителей используются родамин, В-изотиоциант, флюоресценизотиоциант и другие.

Иммунофлюоресцентные методы характеризуются специфичностью и высокой чувствительностью. Они позволяют идентифицировать от­дельные молекулы, попавшие в поле зрения люминесцентного микро­скопа. Для постановки реакции необходимо располагать соответствующими иммунофлюоресцеитными препаратами.

Иммунофлюоресцентные методы применяются для индикаций воз­будителей инфекционных болезней, изучения антигенной структуры микроорганизмов, а также для определения вида антител. На практике используется прямой и непрямой иммунофлюоресцентные методы.

Реакция прямой иммунофлюоресценции

Она основана на непосредственном специфическом взаимодействии антигенов с мечеными антителами. При постановке реакции сначала делают мазок из исследуемого материала, содержащего искомый ан­тиген, или из выращенной культуры исследуемых микроорганизмов. Мазок просушивают и фиксируют. Потом на него наносят специфическую иммунную сыворотку, меченую флюорохромом, выдерживают ее на препарате некоторое время, затем сливают и препарат тщательно промывают водой от несвязавшихся антител. После этого препарат рассмат­ривают в люминесцентном микроскопе. В случае, если исследуемый антиген соответствует применяемым в реакции известным антителам, при люминесцентной микроскопии хорошо видны светящиеся комплексы антиген-антитело.

Достоинства реакции - в ее высокой специфичности, чувстви­тельности, в простоте постановки и возможности получить результа­ты в максимально короткое время. Недостаток - в необходимости иметь большой набор люминесцирующих иммунных сывороток против мно­гих видов возбудителей, что трудно осуществимо для практических лаборатории, учитывая высокую стоимость люминесцирующих препара­тов, а также весьма ограниченные сроки их хранения. Поэтому на практике чаще применяется реакция непрямой иммунофлюоресценции.

Непрямой иммунофлюоресцентный метод

Метод основан на поэтапном выявлении комплексов антиген-анти­тело с помощью флюоресцентных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов при соединении бактериальных (или вирусных) антигенов со специфическими антибактериальными и противовирусными сыворотками. Второй этап - выявление этого комп­лекса путем обработки его меченым антигамма-глобулином. Иными словами, препарат, содержащий антиген (например, холерный) снача­ла обрабатывают специфической (противохолерной) сывороткой. Затем препарат обрабатывают меченой флюорохромом антиглобулиновой сы­вороткой (содержит антитела против глобулинов). Учитывая, что диагностические антибактериальные сыворотки, как правило, получа­ют путем иммунизации кроликов бактериальными антигенами, применяются люминесцирующие антиглобулиновые сыворотки, содержащие антитела к глобулинам кролика. Такую сыворотку можно получить от лошадей, иммунизированных кроличьей сывороткой.

В тех случаях, если антиген соответствует антителам специфи­ческой сыворотки, на первом этапе реакции образуется специфичес­кий комплекс антиген-антитело. При последующем добавлении антиглобулиновой сыворотки, содержащиеся в ней антитела к глобулинам кролика тоже присоединяются к этому комплексу, так как они факти­чески являются антителами антител специфической сыворотки, приме­нявшейся на первом этапе. А так как антиглобулиновая сыворотка мечена флюорохромом, образующиеся комплексы ярко светятся при люминесцентной микроскопии.

Непрямой метод сложнее в постановке, чем прямой, но зато он обладает более высокой чувствительностью. Другое его неоспоримое преимущество - он более доступен, так как с помощью одной и той же антивидовой меченой сыворотки можно выявить различные бакте­риальные антигены, применяя в каждом случае соответствующую видовую немеченую специфическую иммунную сыворотку. Так, имея на­бор немаркированных специфических иммунных сывороток кроликов к различным вирусным, бактериальным антигенам и единую меченую гамма-глобулиновую фракцию лошадиной сыворотки, можно осуществ­лять диагностику многих инфекционных заболеваний с помощью иммунофлюоресцентного метода.