3.2.3. Иммунодиффузия по Оухтерлони

Реакция преципитации может быть поставлена в агаровом геле. Метод основан на том, что частицы антигенов и антител из-за различных размеров диффундируют в геле с неодинаковой скоростью и вследствие этого продвигаются на разные расстояния. Это позволяет разделить отдельные системы антигенов в тех случаях, когда они находятся в смеси, и, следовательно, дает возможность изучить антигенную структуру бактерий и сложных белковых веществ, сывороток и тканей животных.

Наглядный и эффективный метод преципитации в геле предложил Оухтерлони. На чашках Петри с агаром делают небольшие лунки, вырезанные на некотором расстоянии друг от друга. В один из них наливают антиген, в другие - сыворотки. Компоненты реакции диффундируют в геле по направлению друг к другу и образуют видимую линию преципитации там, где антигены встречаются с оптимальными концентрациями специфических для него антител. Поскольку реагенты диффундируют из лунок концентрически, можно провести сразу несколько исследований, если разместить вокруг лунки с антителами несколько лунок с разными антигенами (или с разными разведениями одного и того же антигена).

Реакция Оухтерлони дает возможность делать заключение о природе антигена по известной сыворотке и, наоборот, по известному антигену определяется природа антител. Преимущество метода – в том, что он позволяет сравнить антигенные компоненты сложных смесей и судить об их общности или различиях. Для сравнения общности антигенов готовят агар с лунками: в одну наливают антисыворотку, в другие – сравниваемые антигены. Если антигены различны, то полосы преципитации располагаются неодинаково.

3.2.4. Иммуноэлектрофорез

В последние годы для тонких иммунологических исследований применяется метод иммуноэлектрофореза. Метод впервые описали П. Грабар и К. А. Уильямс в 1953 г. Он представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле на стеклянных пластинках с иммунодиффузией. В начале проводится электрофоретическое разделение антигена, зачастую представляющего собой смесь белковых или других молекул. Для этого антиген вносят в заранее вырезанную в агаре лунку, и пластинку с агаром на некоторое время помещают в зону постоянного электрического тока. Из-за разной скорости движения молекул происходит разделение антигена на составляющие части. После этого в канавку, вырезанную в направлении, параллельном движению тока, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу. Каждый антиген дает зону преципитации в виде дуги с соответствующими для него антителами. Число, положение и форма этих линий дают представление о составе исходной смеси антигена.

3.2.5. Реакция флоккуляции

Метод предложен Рамоном в 1924 году. Он основан на том, что смесь токсина с антитоксической сывороткой в определенных условиях дает помутнение и выпадение осадка. При этом реакция наступает раньше в тех пробирках, где количество антитоксина соответствует дозе, полностью нейтрализующей данное количество токсина. Следовательно, если известна сила токсина, то можно установить количество антитоксина в неизвестной испытуемой сыворотке. Для этого готовят несколько разведений исследуемой сыворотки, добавляют к каждому разведению одинаковые количества известного токсина, после чего наблюдают, в какой из пробирок раньше всего наступит флоккуляция (помутнение раствора). Определяют инициальную флоккуляцию. Затем производиться расчет. Например, требуется определить концентрацию противодифтерийных антител в исследуемой сыворотке. В реакции применяется дифтерийный токсин, содержащий 50 Lf в 1 мл (Lf – это минимальное количество токсина, которое нейтрализуется 1 антитоксической единицей (АЕ) антисыворотки. Допустим, что инициальная флоккуляция отмечена в пробирке, где находилось 0,2 мл этой сыворотки и 2 мл известного токсина активностью 100 Lf (50 Lf х 2). Значит, 0,2 мл сыворотки нейтрализовали этот токсин. Следовательно, 0,2 мл сыворотки содержат 100АЕ, а в 1 мл этой сыворотки концентрация антител соответствует 500 АЕ (100 АЕ х 5).

Аналогичным методом реакцию флоккуляции можно применять и с противоположной целью – для определения иммунизирующих свойств анатоксинов. Для этого необходима стандартная антитоксическая сыворотка.