Вопрос 17. Сравнительный анализ внутрирасового и межрасового генетического полиморфизма. Критика расизма с позиции современной популяционной генетики.

Снипсы (snp) – генетическое сходство и различие между индивидами. Межиндивидуальная вариабельность около 90%, межпопуляционная - не более 10%.

Аллель FY-0 обеспечивает преимущество в отборе в областях, где распространен малярийный плазмодий.

Генетический полиморфизм - долговременное существование в популяции двух и более генотипов, частоты которых достоверно превышают вероятность возникновения соответствующих повторных мутаций.

Невозможно разделить человеческие популяции, основываясь только на особенностях генетического полиморфизма.

Исследования показывают, что вариабельность генов внутри популяции Homo sapiens во много раз выраженнее, чем между популяциями. Расизм - представление о существовании различных видов внутри человеческой популяции - рас, различных по происхождению, генотипу и биометрическим показателям и умственных и соответствующая политика, направленная на закрепление особых статусов за каждой из расовых групп, вплоть до сегрегации (политика принудительного отделения какой-либо группы населения).

Критика расизма заключается в том, что с точки зрения генетики все расы относятся к одному виду – человек, поэтому расовые теории не имеют генетической основы.

Вопрос 18 Влияние ионизирующей радиации, химических и биологических факторов на наследственность. Соматические мутации (злокачественные новообразования, старение). Ядерное оружие и наследственность. Радиационная генетика.

Мутагенные факторы - факторы, способные индуцировать мутационный эффект.

Главные мутагены: химические соединения, различные виды излучений, биологические факторы.

Химический мутагенез.

Химические мутагены должны обладать высокой проникающей способностью, свойством изменять коллоидное состояние хромосом, определенным действием на состояние гена или хромосомы (по мнению М.Е.Лобашова). Йод, аммоний, иприт, формалин, этиленимин - мутагенный эффект.

Химические мутагены используют для получения мутантных форм плесневых грибов, актиномицетов, бактерий, вырабатывающих в большом количестве антибиотики. Химическими мутагенами повышена ферментативная активность грибов, применяемых для спиртового брожения

Старение — в биологии процесс постепенного нарушения и потери важных функций организма или его частей, в частности способности к размножению и регенерации.

Злокачественный рост, или возникновение опухолей, следует рассматривать как особый патологический способ развития клеток.

• Вирусно-генетическая теория

• Физико-химическая теория

• Теория дисгормонального канцерогенеза

• Дизонтогенетическая теория (нарушения эмбриогенеза тканей, что под действием провоцирующих факторов)

• Полиэтиологическая теория (объединяет все вышеперечисленные теории.)

Ионизирующее излучение - излучение, взаимодействие которого с веществом приводит к образованию в этом веществе ионов разного знака. Ионизирующее излучение может представлять собой поток заряженных или незаряженных частиц, а также фотонов.

Биологическое действие ионизирующих излучений.

Ионизация, создаваемая излучением в клетках, приводит к образованию свободных радикалов. Свободные радикалы вызывают разрушения целостности цепочек макромолекул (белков и нуклеиновых кислот), что может привести как к массовой гибели клеток, так и канцерогенезу и мутагенезу. Наиболее подвержены воздействию ионизирующего излучения активно делящиеся (эпителиальные, стволовые, также эмбриональные) клетки.

Для человека дозой рентгеновских и гамма лучей, удваивающих количество естественных мутаций, является доза- 0,5-1,5 гр (50-150рад)

После действия излучения на организм в зависимости от дозы могут возникнуть детерминированные и стохастические радиобиологические эффекты. Например, порог появления симптомов острой лучевой болезни у человека составляет 1-2 Зиверт на всё тело. В отличие от детерминированных, стохастические эффекты не имеют чёткого дозового порога проявления. С увеличением дозы облучения возрастает лишь частота проявления этих эффектов. Проявиться они могут как спустя много лет после облучения (злокачественные новообразования), так и в последующих поколениях (мутации).

Опасность испытаний ядерного оружия очевидна. Это может привести к серьезным генетическим последствиям для человечества.

В тоже время применение атомной энергии в генетике и селекции позволит создать новые методы изменения наследственности растений, животных и микроорганизмов , глубже понять процессы генетической адаптации организмов. Биологические мутагены - вирусы и токсины ряда организмов, особенно плесневых грибов. Мутагенным действием обладают патогенные и непатогенные для организма вирусы. Причина мутаций кроется в способности вирусов глубоко изменять метаболизм клетки.

Вопрос 19. Геном человека: реализованные и предстоящие задачи, общие представления о протеоме человека. Причины несоответствия количества белков протеома количеству генов генома человека. Проект «Геном человека»: цели, задачи, основные результаты, перспективы для здравоохранения. Проблема клонирования. Тканевая инженерия и применение стволовых клеток в медицине – базовые принципы.

Геном — совокупность всех генов организма; его полный хромосомный набор.

Геном человека — это геном биологического вида Homo sapiens. В нормальной ситуации в большинстве клеток человека должно присутствовать 46 хромосом: 44 из них не зависят от пола (аутосомные хромосомы), а две — X-хромосома и Y-хромосома — определяют пол (XY — у мужчин или ХХ — у женщин). Хромосомы в общей сложности содержат приблизительно 3 миллиарда пар оснований нуклеотидов ДНК, в которых по оценкам содержится 20000-25000 генов.  В ходе выполнения проекта «Геном человека» содержимое хромосом находящихся в стадии интерфаза в клеточном ядре (вещество эухроматин) было выписано в виде последовательности символов. В настоящее время эта последовательность активно используется по всему миру в биомедицине. В ходе исследований выяснилось, что человеческий геном содержит значительно меньшее число генов, нежели ожидалось в начале проекта. Только для 1,5 % всего материала удалось выяснить функцию, остальная часть составляет так называемую мусорную ДНК.  В эти 1,5 % входят собственно сами гены, которые кодируют РНК и белки, а также их регуляторные последовательности, интроны и, возможно, псевдогены.

Протеом — термин для обозначения полного комплекта белков (протеинов), имеющихся в организме. Молекулы белков управляют всеми обменными процессами, протекающими в организме — пищеварением, выработкой гормонов или электрическим возбуждением нервных клеток и пр. Любые молекулярно-биологические процессы, происходящие в организме, отражаются в протеоме.

Проект «Геном человека» (Проект по расшифровке генома человека) (The Human Genome Project, HGP) — международный научно-исследовательский проект,

главной целью которого было определить последовательность нуклеотидов, которые составляют ДНК и идентифицировать 20,000-25,000 генов в человеческом геноме.

Проект начался в 1990 году, под руководством Джеймса Уотсона под эгидой Национальной организации здравоохранения США. В 2000 году был выпущен рабочий черновик структуры генома, полный геном — в 2003, однако и сегодня дополнительный анализ некоторых участков ещё не закончен. Частной компанией Celera Genomics был запущен аналогичный параллельный проект, завершенный несколько ранее международного. Основной объём секвенирования был выполнен в университетах и исследовательских центрах США, Канады и Великобритании. Кроме очевидной фундаментальной значимости, определение структуры человеческих генов является важным шагом для разработки новых медикаментов и развития других аспектов здравоохранения.

Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их первичной аминокислотной или нуклеотидной последовательности. Хотя целью проекта по расшифровке генома человека является понимание строения генома человеческого вида, проект также фокусировался и на нескольких других организмах, среди которых бактерии, в частности, Escherichia coli, насекомые, такие как мушка дрозофила, и млекопитающие, например, мышь. Геном любого отдельно взятого организма (исключая однояйцевых близнецов и клонированных животных) уникален, поэтому определение последовательности человеческого генома в принципе должно включать в себя и секвенирование многочисленных вариаций каждого гена. Однако, в задачи проекта «Геном человека» не входило определение последовательности всей ДНК, находящейся в человеческих клетках; а некоторые гетерохроматиновые области (в общей сложности около 8 %) остаются несеквенированными до сих пор.

Другая, часто упускаемая из виду цель проекта «Геном человека» — исследование этических, правовых и социальных последствий расшифровки генома. Важно исследовать эти вопросы и найти наиболее подходящие решения до того, как они станут почвой для разногласий и политических проблем.

Все люди имеют в той или иной степени уникальные геномные последовательности. Поэтому данные, опубликованные проектом «Геном человека», не содержат точной последовательности геномов каждого отдельного человека. Это комбинированный геном небольшого количества анонимных доноров. Полученная геномная последовательность является основой для будущей работы по идентификации разницы между индивидуумами. Основные усилия здесь сосредоточены на выявлении однонуклеотидного полиморфизма. Почти все цели, которые ставил перед собой проект, были достигнуты быстрее, чем предполагалось. Проект по расшифровке генома человека был закончен на два года раньше, чем планировалось. Проект поставил разумную, достижимую цель секвенирования 95 % ДНК. Исследователи не только достигли её, но и превзошли собственные предсказания, и смогли секвенировать 99,99 % человеческой ДНК.

Завершённость. Согласно определению, которое использует Международный проект по расшифровке генома человека, геном расшифрован полностью. График истории расшифровки проекта показывает, что большая часть человеческого генома была закончена в конце 2003 года. Однако ещё остаётся несколько регионов, которые считаются незаконченными:

Прежде всего, центральные регионы каждой хромосомы, известные как центромеры, которые содержат большое количество повторяющихся последовательностей ДНК; их сложно секвенировать при помощи современных технологий. Центромеры имеют длину миллионы (возможно десятки миллионов) пар нуклеотидов, и, по большому счёту, остаются несеквенированными.

Во-вторых, концы хромосом, называемые теломерами, также состоящие из повторяющихся последовательностей, и по этой причине в большинстве из 46 хромосом их расшифровка не завершена. Точно неизвестно, какая часть последовательности остаётся не расшифрованной до теломер, но, как и с центромерами, существующие технологические ограничения препятствуют их секвенированию.

В-третьих, в геноме каждого индивидуума есть несколько локусов, которые содержат членов мультигенных семейств, которые также сложно расшифровать с помощью основного на сегодняшний день метода фрагментирования ДНК. В частности, эти семейства кодируют белки, важные для иммунной системы.

Кроме перечисленных регионов, остаётся ещё несколько брешей, разбросанных по всему геному, некоторые из которых довольно крупные, но есть надежда, что все они будут закрыты в ближайшие годы.

Большая часть остающейся ДНК сильно повторяющаяся, и маловероятно, что она содержит гены, однако это останется неизвестным, пока они не будут полностью секвенированы. Понимание функций всех генов и их регуляции далека от завершения. Роль мусорной ДНК (последовательности геномной ДНК, функции которых пока не установлены), эволюция генома, различия между индивидуумами, и многие другие вопросы по-прежнему являются предметом интенсивных исследований в лабораториях всего мира.

Задачи проекта:

1. Расшифровать структуру ДНК всех хромосом человека, определить последовательность нуклеотидов

2. Разграничить структурные и оперирующие и регулирующие гены, т.е регуляторные (определяют режим активности, условия). Через регуляторные гены структурны гены общаются с окружающей средой

3. Установление факторов, влияющих на работу данного гена

4. Расшифровать все аллельные модификации (от 2 и более). В том числе аномальные

Некоторые гены в течение онтогенеза меняют свое предназначение (смена функции).

Полученная информация позволит:

Даст возможность создания индивидуальных генетических карт ,по этим картам с высокой степенью достоверности можно предположить какие заболевания могут развиться у данного человека и в каком возрасте

На новом уровне развивать тканевую инженерию. Возможность выращивания искусственны органов на генетической основе для отдельного человека

Разработать перечень заболеваний, при которых можно использовать генетическую терапию.

Генетическая терапия - направленная замена гена.

Направления молекулярной генетики.

Клонирование — метод получения нескольких генетически идентичных организмов путем бесполого (в том числе вегетативного) размножения.

Клонирование человека — этическая и научная проблема конца XX-го — начала XXI-го века, состоящая в технической возможности приступить к формированию и выращиванию принципиально новых человеческих существ, точно воспроизводящих не только внешне, но и на генетическом уровне того или иного индивида, ныне существующего или ранее существовавшего — вместе с полной этической неподготовленностью к этому обществу.

Цель клонирования: создание генотипической и фенотипической копии, полностью тождественной клонируемой.

Берется соматическая (не половая) клетка, предполагается, что она должна быть полным аналогом зиготы, из которой выросла данная особь. В принципе такую клетку не найти:

1. Все клетки взрослого организма хотя и содержат диплоидный набор хромосом, но ее генетический состав не соответствует на 100% генетическому составу зиготы, т.к все клетки проходят дифференцировку. А дифференцировка предполагает преобразование генетического состава. Пример- эритробласт.

2. Все клетки имеют шанс развития в них спонтанных мутаций, причем они не определены, т.е. она не изменяет ее жизнедеятельность. Если из этой клетки получить особь, тогда мутация отразится

3. При клонировании берут ядро, а цитоплазма используется яйцеклетки другой особи, возникает вопрос цитоплазматической наследственности. Митохондрии имеют свою ДНК.

1. Из многочисленных попыток клонирования млекопитающих лишь очень малый процент завершился рождением полноценной особи, хотя фенотипически эта особь не отличается от клонируемой. С точки зрения молекулярной биологии реальности этих программ нет

Препятствия клонированию:

• Технологические трудности и ограничения

• Социально-этический аспект

• Этико-религиозный аспект

• Отношение в обществе

• Биологическая безопасность

• Правовой аспект

Вопрос 20. Генная инженерия (ее направления, технический алгоритм) и генная терапия. Векторы доставки генов. Основные направления генной инженерии и генной терапии. Генная терапия моногенных болезней.

Генетическая инженерия (генная инженерия) — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.

Генная инженерия- это научное направление, цель которого, направленное преобразование определенных функций организма, при внесении организму заданных свойств или коррекции генетических аномалий. Ген. инженерия растений - направленная селекция. Ген. инженерия животных - генетическая терапия. Цель - у экспериментальных животных иногда имеет смысл внедрения гена для создания каких то заболеваний (трансгенные мыши).

Принципы:

1. замена гена (аномального) в какой-то клеточной популяции

2. замена гена на его здоровую копию во всех клетках особи(сложнее).

2 группы болезней:

• Моногенные заболевание обусловлено дефектом одного гена

• Полигенные - на развитие болезни оказывают влияние несколько разных генов.

Вероятность развития - предрасположенность

Основные этапы решения генно-инженерной задачи следующие:

1. Получение изолированного гена.

2. Введение гена в вектор для переноса в организм.

3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.

4. Преобразование клеток организма.

5. Отбор генетически модифицированных организмов (ГМО) и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100—120 азотистых оснований (олигонуклеотиды). Получила распространение техника, позволяющая использовать для синтеза ДНК, в том числе мутантной, полимеразную цепную реакцию. Термостабильный фермент, ДНК-полимераза, используется в ней для матричного синтеза ДНК, в качестве затравки которого применяют искусственно синтезированные кусочки нуклеиновой кислоты — олигонуклеотиды. Фермент обратная транскриптаза позволяет с использованием таких затравок (праймеров) синтезировать ДНК на матрице выделенной из клеток РНК. Синтезированная таким способом ДНК называется комплементарной (РНК) или кДНК. Изолированный, «химически чистый» ген может быть также получен из фаговой библиотеки. Так называется препарат бактериофага, в геном которого встроены случайные фрагменты из генома или кДНК, воспроизводимые фагом вместе со всей своей ДНК. Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты — рестриктазы и лигазы, также являющиеся полезным инструментом генной инженерии. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит также были удостоены Нобелевской премии (1978 г.). Техника введения генов в бактерии была разработана после того, как Фредерик Гриффитс открыл явление бактериальной трансформации. В основе этого явления лежит примитивный половой процесс, который у бактерий сопровождается обменом небольшими фрагментами нехромосомной ДНК, плазмидами. Плазмидные технологии легли в основу введения искусственных генов в бактериальные клетки. Значительные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных. Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку. Такой процесс получил название трансфекция.

Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование, то есть отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с изменённым генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идёт о животных. В результате рождаются детеныши с изменённым или неизменным генотипом, среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.

Векторы доставки генов – ретровирус, которому вместо вирулентного компонента внедрили нормальный ген., а затем в пробирке инкубировали ретровирус и стволовые клетки больных детей. Вирус внедряется в ДНК хозяина, покидает его и часть своей ДНК оставляет в клетке. В клетках появляется фермент, клетки возвращают в кровоток.

СПИД, болезни накопления, гемофилия, наследственная гиперхолестеринемия, онкопатологии, муковисцидоз. потенциально могли бы быть вылечены генной терапией.

Средства доставки нормального гена: ретровирус (тропный к митотически активным клеткам, но встраивается не совсем легко представить куда).

Аденовирусы более точно встраиваются, но их труднее избавить от вирулентных свойств.

Основные проблемы генной инженерии: стабильность внедрения гена, целенаправленность действия, регуляция активности гена, безопасность средства доставки.

Несколько тысяч человек излечены методом генной терапии

Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакториальных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций.

Генная терапии.

• Ликвидируется генетическая первопричина.

• Замена дефектного гена

• Лечение онкопатологии