1.4.1. Интраназальное заражение

Метод используют для выделения пневмотропных вирусов. Заражение мышей проводится под эфирным наркозом. Животных помещают в закрытую стеклянную банку, в которую положен кусок ваты, пропитанный эфиром. С помощью шприца или пастеровской пипетки в ноздри животного вводят 0,03-0,1 мл заражающего материала. За животными устанавливается наблюдение, при проявлении признаков заболевания мышей забивают при помощи эфирного наркоза, а затем вскрывают.

Этапы вскрытия животных:

1. Увлажнённый 5%-ным раствором лизола или фенола труп мыши фиксируют брюшком кверху на поверхности кюветы со смесью воска и парафина.

2. Обрабатывают кожные покровы спиртом, йодом и вновь спиртом; опаливают пламенем.

3. Ножницами делают продольный разрез кожи от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы к лапкам, отсепаровывают её.

4. Вскрывают грудную полость, вырезав грудину ножницами по рёберным хрящам.

5. Осматривают внешний вид органов грудной полости, обращая внимание на наличие экссудата. Извлекают лёгкие при строгом соблюдении асептики и сохраняют их при минусовой температуре в морозильнике до получения ответа на бактериологический контроль-результат посева кусочка легочной ткани в мясо-пептонный бульон (после выдерживания его в термостате при 37⁰С в течение суток).

6. При отрицательном контроле на бактериальную загрязнённость готовят 10%-ную суспензию легочной ткани путём растирания ткани в фарфоровой ступке, с постепенным добавлением физиологического раствора.

7. Суспензию центрифугируют для осаждения крупных частиц при 1500 об/мин, надосадочную жидкость собирают и используют для последующего вирусологического исследования.

1.4.2. Интрацеребральное заражение

Метод предназначен для выделения нейротропных вирусов. При заражении мыши в мозг её плотно прижимают левой рукой к столу, большим и указательным пальцами оттягивают кожу головы к затылку, мизинцем и безымянным фиксируют хвост. Лобный участок головы предварительно обрабатывают 3%-ной йодной настойкой. Заражающий материал (кровь) в объёме 0,02-0,03 мл вводят в мозг туберкулиновым шприцем с тонкой иглой путём прокола лобной кости на глубину 1,5-2 мм.

Этапы вскрытия животных:

1. Труп увлажняют раствором лизола или фенола.

2. Обрабатывают кожные покровы головы последовательно спиртом, йодом и вновь спиртом, опаливают пламенем.

3. Вскрывают и отделяют кожу головы. Отрезают голову, помещают её в стерильную чашку Петри, проведя предварительно через пламя горелки.

4. Вскрывают ножницами черепную коробку, извлекают мозг и сохраняют его в замороженном состоянии до получения результата бактериологического контроля.

5. В случае отрицательного бактериологического контроля из мозговой ткани приготавливают 10%-ную суспензию в физиологическом растворе. Освобождают её от крупных тканевых частиц центрифугированием, надосадочную жидкость используют для вирусологической работы.

На лабораторных животных проводят титрование вирусов, ставят реакцию нейтрализации; животных используют для получения вирусных вакцин, диагностикумов, противовирусных сывороток.

28. Строение куриного эмбриона и методы его заражения. Культивирование и индикация вирусов в курином эмбрионе.

Методика получения первичных культур фибробластов куриного эмбриона

1. Яйца, инкубированные 7-11 дней, овоскопируют. Убедившись в жизнеспособности эмбриона, очерчивают границу воздушного мешка.

2. Скорлупу на тупом конце яйца протирают спиртом, йодом, снова спиртом, а затем срезают на уровне воздушного мешка.

3. Извлекают эмбрион и помещают его в стерильную чашку, удаляют голову. Тело эмбриона омывают 3-5 мл раствора Хенкса, который затем отсасывают.

4. Тело эмбриона тщательно измельчают ножницами, полученные кусочки (размером около 1 мм³) пипеткой переносят в пробирку.

5. Проводят 2-3-кратное отмывание измельчённой ткани от крови. Каждый раз наливают в пробирку с тканью по 2-3 мл раствора, дают ткани осесть, после чего жидкость отсасывают.

6. К отмытой ткани добавляют 3 мл 0,25% раствора трипсина и тщательно перемешивают содержимое пробирки с помощью «пипетирования» (многократного насасывания и выдувания жидкости пипеткой) или энергичного встряхивания. Под действием трипсина клетки ткани разъединяются и образуют суспензию, поэтому после оседания более крупных тканевых частиц на дно пробирки жидкость над осадком должна остаться мутной.

7. Верхний помутневший слой жидкости, содержащий взвесь изолированных клеток, переносят в центрифужную пробирку, куда заранее наливается 2,5 мл питательной среды гидролизата лактальбумина. Проводят центрифугирование при 1 000 об/мин в течение 10-15 минут.

8. Надосадочную жидкость удаляют, к осадку клеток добавляют 2-3 мл гидролизата лактальбумина и тщательно перемешивают, чтобы клетки вновь оказались во взвешенном состоянии. Для отделения конгломератов клеток, которые могут попасть во взвесь, рекомендуется последующее фильтрование через сетку из нержавеющей стали или марлю.

9. Производится подсчёт клеток в камере Горяева под малым увеличением микроскопа. Определив концентрацию клеток во взвеси, её разводят гидролизатом лактальбумина до 400 000 клеток в 1 мл.

10. Взвесь разливают в пробирки по 1 мл, закрывают резиновыми пробками и помещают в термостат при 37⁰С в наклонном положении под углом 5⁰.

Через 3-4 суток от начала культивирования, просматривая пробирки при малом увеличении микроскопа, можно видеть вытянутые, отростчатые клетки – фибробласты, которые растут на стенке пробирки, образу монослой.