1. Механизмы питания и классификация бактерий по типам питания.

Различают углеродное и азотное питание.

I. По типу углеродного питания микроорганизмы принято делить на аутотрофы и гетеротрофы. Аутотрофы (прототрофы) – микроорганизмы, способные воспринимать углерод из углекислоты воздуха. К ним относятся нитрифицирующие бактерии, железобактерии, серобактерии. Аутотрофы способны использовать воспринятую углекислоту для синтеза сложных органических соединений. Таким образом, аутотрофы обладают способностью синтезировать сложные органические соединения из неорганических. Поскольку такие микробы не нуждаются в готовых органических соединениях, среди них нет болезнетворных. Однако среди аутотрофов встречаются микроорганизмы, обладающие способностью усваивать углерод  из углекислоты воздуха и из органических соединений. Такие микроорганизмы, имеющие смешанный тип питания определены как миксотрофы.Гетеротрофы в противоположность аутотрофам используют углерод из любых готовых органических соединений (чаще всего это углерод спиртов, сахаров, органических кислот, многоатомных спиртов). К гетеротрофам принадлежат возбудители различного рода брожений, гнилостные микробы и микроорганизмы – возбудители различных заболеваний. Однако деление микроорганизмов на аутотрофы и гетеротрофы достаточно условно, так как при изменении условий среды обмен веществ у микроорганизмов может меняться.Гетеротрофы включают в себя две подгруппы: метатрофы (сапрофиты) – живут за счет использования мертвых субстратов (гнилостные микроорганизмы) и паратрофы - паразитические микроорганизмы, живущие на поверхности или внутри организма хозяина и питающиеся за его счет.

II.  По способу усвоения азотистых веществ микроорганизмы подразделяют на четыре группы:

·        Протеолитические, способные расщеплять нативные белки, пептиды, аминокислоты.

·        Дезаминирующие, способные отщеплять аминогруппы только у свободных аминокислот.

·        Нитритно-нитратные, усваивающие окисленные формы азота.

·        Азотфиксирующие, обладающие свойством усваивать атмосферный азот.

Потребность микроорганизмов в зольных элементах невелика. Необходимые для жизни минеральные соединения присутствуют в естественной среде обитания.Все изученные бактерии нуждаются в витаминах или ростовых веществах, которые играют роль катализаторов биохимических процессов микробной клетки. Они же служат структурными единицами при образовании некоторых ферментов. К витаминам, необходимым микробной клетке принадлежат: биотин, витамины группы В, витамин К и ряд других. Избыток витаминов задерживает рост бактерий.Кроме витаминов к факторам роста бактерий относят пуриновые и пиримидиновые основания (аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин). Некоторые микроорганизмы в качестве ростовых факторов используют аминокислоты, синтезируемые самой микробной клеткой или находящиеся в среде. Некоторые микроорганизмы обладают способностью синтезировать ростовые факторы в относительно больших количествах, обеспечивая не только свои потребности, но и интенсивно выделяя синтезируемые вещества в окружающую среду. Например, пропионовокислые бактерии способны синтезировать витамин В₁₂, что активно используется в промышленности.Кроме описанных способов получения микроорганизмами питательных веществ часто применяется классификация микроорганизмов в зависимости от источника энергии:

·        Фототрофные микроорганизмы – это микроорганизмы, способные использовать в качестве источника энергии свет. Например, синезеленые водоросли, пурпурные серобактерии. Эти микроорганизмы содержат пигменты, по своему составу близкие к хлорофиллу растений.

·        Хемотрофные микроорганизмы получают энергию в результате окислительно-восстановительных реакций с участием питательных субстратов.

2. Транспорт метаболитов у бактерий: пассивная и облегченная диффузия, активный транспорт. Вещества и условия, необходимые для роста микробной популяции. Понятие о прототрофах и ауксотрофах.

   Пассивная диффузия через мембраны клетки - вероятностный процесс пассивного перемещения малых молекул через мембраны клетки в обоих направлениях.       Пассивная диффузия зависит от размера, степени гидратации и плотности заряда перемещающихся частиц (ионов),градиента концентрации частиц на наружной и внутренней поверхностях мембраны, трансмембранной разности потенциалов, градиента гидростатического давления на мембране, температуры. Полагают, что в мембранах имеются управляемыетранспортные каналы, построенные из белков, по которым осуществляется движение частиц. Число каналов, число открытых каналов, моменты времени открытия каналов и все другие их характеристики - вероятностные управляемые характеристики, описываемые вероятностными переменными. Управляющими сигналами могут быть химические вещества (ионы,нейромедиаторы и др., потенциалнезависимые каналы мембран) и изменение потенциала мембраны (потенциалзависимые каналы мембран). Каналы специализированы для проведения разных ионов. В частности, получены данные о наличии специальных каналов для транспорта Na⁺, K⁺ и Ca²⁺ и других ионов.

При облегченной диффузии вещества переносятся через мембрану также по градиенту концентрации, но с помощью специальных трансмембранных белков-переносчиков (транслоказ). Белок-переносчик имеет центр связывания, комплементарный переносимому веществу, поэтому для облегченной диффузии, в отличие от простой, характерна высокая избирательность: для каждого вещества или группы сходных веществ имеется свой переносчик.

Активный транспорт — перенос вещества через клеточную или внутриклеточную мембрану (трансмембранный А.т.) или через слой клеток (трансцеллюлярный А.т.), протекающий против градиента концентрации из области низкой концентрации в область высокой, т. е. с затратой свободной энергии организма. В большинстве случаев, но не всегда, источником энергии служит энергия макроэргических связей АТФ.

Различные транспортные АТФазы, локализованные в клеточных мембранах и участвующие в механизмах переноса веществ, являются основным элементом молекулярных устройств — насосов, обеспечивающих избирательное поглощение и откачивание определенных веществ (например, электролитов) клеткой. Активный специфический транспорт неэлектролитов (молекулярный транспорт) реализуется с помощью нескольких типов молекулярных машин — насосов и переносчиков. Транспорт неэлектролитов (моносахаридов, аминокислот и других мономеров) может сопрягаться с симпортом — транспортом другого вещества, движение которого по градиенту концентрации является источником энергии для первого процесса. Симпорт может обеспечиваться ионными градиентами (например, натрия) без непосредственного участия АТФ.

В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на питательных средах, которые должны быть стерильными, про­зрачными, влажными, содержать определенные питательные вещества (белки, углеводы, витамины, микроэлементы и др.), обладать определенной буферностью, иметь соответствующий рН, окислительно-восстановительный потенциал. 

Прототрофные микроорганизмы, не требующие (в отличие от ауксотрофов) для своего развития готовых витаминов, аминокислот или др. факторов роста, а синтезирующие их из минеральных или органических соединений. Один и тот же микроорганизм может быть прототрофным по одному фактору роста, но ауксотрофным по другому. Термин «П.» предложен немецким учёным А. Фишером и сначала использовался как синоним автотрофных организмов для характеристики бактерий, не нуждающихся в органических веществах и растущих на минеральных средах.

АУКСОТРОФЫ (от греческого auxo — выращиваю, увеличиваю и ...троф), организмы (чаще микроорганизмы), утратившие способность к самостоятельному синтезу какого-либо метаболита (аминокислоты, витамина, азотистого основания и т. д.) в результате мутации и потери способности к образованию определённого фермента. Ауксотрофы могут расти только на средах, в которые этот метаболит добавлен. Организм дикого типа, способный развиваться в той же среде без добавления питательных веществ, называют прототрофом. Ауксотрофы широко используются в генетических и других биологических исследованиях.

3. Дыхание бактерий. Типы дыхания в зависимости от донора и акцептора электрона. Защита микроорганизмов от токсических производных молекулярного кислорода.

Дыхание, основано на окислительно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление – отдача донорами (молекулами или атомами) водорода; восстановление – присоединение водорода к акцептору. Анаэробиоз (от греч. аег – воздух + bios – жизнь) – жизнедеятельность, протекающая при отсутствии свободного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называется брожением. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения.

По отношению к кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязательные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы.

Облигатные аэробы могут расти только при наличии кислорода. Облигатные анаэробы (клостридии ботулизма, газовой гангрены, столбняка, бактероиды и др.) растут только на среде без кислорода, который для них токсичен. Факультативные анаэробы могут расти как при наличии, так и при отсутствии кислорода, поскольку они способны переключаться с дыхания в присутствии молекулярного кислорода на брожение в его отсутствие..Среди облигатных анаэробов различают аэротолерантные бактерии, которые сохраняются при наличии молекулярного кислорода, но не используют его.

Для выращивания анаэробов в бактериологических лабораториях применяют анаэростаты – специальные емкости, в которых воздух заменяется смесью газов, не содержащих кислорода. Воздух можно удалять из питательных сред путем кипячения, с помощью химических адсорбентов кислорода, помещаемых в анаэростаты или другие емкости с посевами.

Резкое возрастание масштабов взаимодействия прокариот с O2 при функционировании метаболизма аэробного типа делает неэффективными неферментативные пути устранения H2O2. Для разложения перекиси водорода, образующейся в больших количествах, необходимы специальные ферменты, повышающие скорость разложения H2O2 на несколько порядков. Это обеспечивается каталазой и пероксидазой. Таким образом, в условиях активного взаимодействия клеток с O2, делающего возможным аэробную жизнь, система ферментной защиты от его токсических эффектов сформирована с участием супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы в качестве необходимых компонентов (рис. 87).

Механизмы защиты с помощью клеточных метаболитов. Защита против одного из самых токсичных производных O2 — синглетного кислорода — осуществляется с помощью разных биологически важных молекул. Все виды тушения *O2 можно разделить на физические и химические. Физическим называют тушение, которое не приводит к разрушению тушителя:

*O2 + A ® O2 + A Химическое тушение приводит к окислению тушителя:

*O2 + A ® O2 + Aок

Преимущественно по химическому механизму тушение *O2 осуществляется насыщенными жирными кислотами, липидами, аминокислотами, нуклеотидами и другими соединениями. Механизмы химического тушения разнообразны, но в большинстве случаев начальной стадией является образование лабильной циклической перекиси с последующим ее разложением, которое приводит к возникновению свободных радикалов. Химическое тушение *O2 может приводить в клетке к существенным деструктивным последствиям.

4. Питательные среды для культивирования микроорганизмов. Простые, сложные, элективные, дифференциально-диагностические, синтетические, консервирующие среды. Требования к питательным средам.

Питательной средой - среды, содер­жащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Питательные среды готовят из продуктов животного или рас­тительного происхождения.

Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного про­исхождения с добавлением неорганических солей, угле­водов и азотистых веществ.

В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин—кислотный гидролизат крови животных, аминопептид — ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.

По консистенции питательные среды могут быть жид­кими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем до­бавления к жидкой среде агара, желатин Ряд естественных питательных сред (свернутая сы­воротка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными.

По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференци­ально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — пита­тельный агар. Такие среды служат основой для приготов­ления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бак­терий.

Элективные питательные среды предназначены для избира­тельного выделения и накопления микроорганизмов определен­ного вида из материалов, содержа­щих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особен­ностей, которые отличают данные микроорганизмы от большин­ства других (рост стафилококков на­блюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, хо­лерного вибриона — в щелочной среде )

Дифференциально-диагностические питательные среды при­меняются для разграничения отдельных видов (или групп) мик­роорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохи­мической активности вследствие неодинакового набора фермен­тов.

Особую группу составляют синтетические и полусинтетиче­ские питательные среды. В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества.

В последние годы для уско­ренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются микротест-системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся сте­рильные дифференциально-диагностические среды. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Требования, предъявляемые к питательным средам.

Любая питательная среда должна отвечать следующим тре­бованиям: содержать все необходимые для размножения микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме; иметь оптимальные влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по воз­можности прозрачной. Каждую питательную среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава.

5. Техники посева бактерий на жидкие и плотные питательные среды. Условия культивирования бактерий. Аппаратура для культивирования микроорганизмов.

Универсальным инструментом для производства посевов явля­ется бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом при­меняют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пасте­ровские и градуированные пипетки.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая дру­гими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной ма­териал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней ча­сти среды, и  зигзагообразным движением  распределяют  мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надг писывают, указывая дату посева и характер посевного мате­риала  (номер исследования или название культуры).

Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, пет­лей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горел­ки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Методы культивирования анаэробов.

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, соз­дать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и био­логических методов.Физические методы. Основаны на выращивании мик­роорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;2) посевом микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред;3) механическим удалением воздуха из сосудов, в ко­торых выращиваются анаэробные микроорганизмы;

4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индиффе­рентным газом.

В качестве редуцирующих веществ обычно использу­ют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Чтобы уменьшить содер­жание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, а затем быстро охлаждают и зали­вают сверху небольшим количеством стерильного вазе­линового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.В качестве легко окисляемых веществ используют глю­козу, лактозу и муравьинокислый натрий.

Посев микроорганизмов в глубину плотных сред про­изводят по способу Виньяль — Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диа­метром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в ка­пилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капилляр­ный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выде­ления отдельной колонии трубку надрезают напильни­ком, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ло­мают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальней­шего выращивания и изучения в чистом виде.Удаление воздуха производят путем его механическо­го откачивания из специальных приборов — анаэроста-тов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостен­ный металлический цилиндр с хорошо притертой крыш­кой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.Замену воздуха индифферентным газом (азотом, во­дородом, аргоном, углекислым газом)  можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.Химические методы. Основаны на поглощении кисло­рода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na2S204.

Биологические методы. Основаны на совместном вы­ращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шири­ной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засе­вают аэроб, например часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают ана­эроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размно­жаться аэробы. После того, как весь кислород в прост­ранстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). В целях сокращения воздуш­ного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

Комбинированные методы. Основаны на сочетании фи­зических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

6. Культуральные свойства бактерий. Характеристика колоний. Пигменты бактерий.

Культуральные свойства бактерий

питательные потребности, условия роста и характер роста бактерий на бактериол. средах. В питательные потребности включают источники углерода, азота и ростовых факторов, способность бактерий расти на определенных питательных средах, в условия роста -рН,Eh, концентрацию О₂ плотность, осмотическое давление среды, температуру роста; в характер роста - скорость роста (быстрый, медленный), внешний вид к-ры на жидких, плотных и полужидких средах, изменения, к-рые наступают в среде или отдельных ее компонентах в процессе роста микробов. Сведения о К.с. используют при выборе способов культивирования и при идентификации выделенной к-ры.

К. м. бывают крупные или мелкие, гладкие или складчатые, блестящие или матовые, с краями ровными, лопастными или др., сероватые или, при образовании пигментов, окрашенные в различные оттенки желтого, оранжевого, красного или др. цветов; колонии плесневых грибов покрыты пушистым налетом. Характеристика колонии по форме, цвету и др. обычно входит в описание вида микроорганизма.

7. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения бактерий в замкнутой среде (периодическая культура). Непрерывное культивирование.

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом — фор­мированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размноже­нием — самовоспроизведением, приводящим к увеличению ко­личества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут раз­множаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные — путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной ни­тью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра — нуклеоида.

Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элон­гация, или рост цепи, и терминация.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура — непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов:1.лаг-фаза;2. фаза логарифмического роста; 3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрациибактерий; 4. фаза гибели бактерий.

Лаг-фаза — период между по­севом бактерий и началом размножения. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жиз­неспособных клеток остается без изменений, составляя макси­мальный уровень Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бак­терий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолирован­ные колонии округлой формы с ровными или неровными кра­ями (S- и R-формы), различной консистенции и цве­та, зависящего от пигмента бактерий.

Многие пигменты обладают ан­тимикробным, антибиотикоподобным действием.

Более перспективно непрерывное культивирование. Его сущность заключается в том, что в ферментаторе поддерживаются постоянные условия среды, в результате чего микроорганизмы остаются в определенном физиологическом состоянии. Подается свежая питательная среда и удаляется избыток среды с продуктами метаболизма, поддерживается фаза экспоненциального роста. Если для культивирования продуцента используется один ферментатор, то говорят о гомогенно-непрерывном процессе. Если же используется батарея, то это гетеро-непрерывный процесс, так как в каждом ферментаторе, соединенном в батарею, поддерживаются постоянные условия. При непрерывном культивировании микроорганизмов отсутствует смена фаз развития культуры. В таких процессах скорость потока питательной среды и отвода культуральной жидкости из системы необходимо отрегулировать, чтобы концентрация клеток оставалась постоянной. В стерильных условиях непрерывный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.

8. Методы выделения чистой культуры и идентификация аэробных бактерий.

Метод последовательных разведений, предложен Л. Пастером, был одним из самых первых, который применялся для механического разъединения микроорганизмов. Он заключается в проведении последовательных серийных разведений материала, который содержит микробов, в стерильной жидкой питательной среде. Этот прием достаточно кропотлив и несовершенный в работе, поскольку не позволяет контролировать количество микробных клеток, которые попадают в пробирки при разведениях.

Этого недостатка не имеет метод Коха (метод пластинчатых разведений). Р.  Кох использовал плотные питательные среды на основе желатины или агар-агара. Материал с ассоциациями разных видов бактерий разводился в нескольких пробирках с растопленным и кое-что охлажденным желатином, содержание которых позже выливалось на стерильные стеклянные пластины. После застудневания среды оно культивировалось при оптимальной температуре. В его толще образовывались изолированные колонии микроорганизмов, которые легко могут быть перенесены на свежуюпитательную среду с помощью платиновой петли для получения чистой культуры бактерий.

Метод Дригальского является более совершенным методом, который широко распространен в повседневной микробиологической практике. Сначала на поверхность среды в чашке Петри пипеткой или петлей наносят исследуемый материал. С помощью металлического или стеклянного шпателя его тщательным образом втирают в среду. Чашку во время посева держат привидкритою и осторожно вращают, чтобы равномерно распределить материал. Не стерилизуя шпателя, проводят им занял материалу в другой чашке Петри, при потребности – в третьей. Только после этого шпатель окунают в дезинфикуючий раствор или прожаривают в пламени горелки. На поверхности среды в первой чашке наблюдаем, как правило, сплошной рост бактерий, во второй – густой рост, а в третьей – рост в виде изолированных колоний.

 

Колонии по методу Дригальского

 

Метод штриховых посевов сегодня используется в микробиологических лабораториях чаще всего. Материал, который содержит микроорганизмы, набирают бактериологической петлей и наносят на поверхность питательной среды возле края чашки. Снимают избыток материала и проводят занял его параллельными штрихами от края к краю чашки. Спустя сутки инкубации посевов при оптимальной температуре на поверхности чашки вырастают изолированные колонии микробов.

 

 

Метод штрихов

 

Для получения изолированных колоний можно использовать занял тампоном, которым проводили забор исследуемого материала. Несколько приоткрывают чашку Петри с питательной средой, вносят туда тампон и осторожными движениями втирают материал в поверхность чашки, возвращая постепенно тампон и чашку.

Таким образом, существенное преимущество методов пластинчатых разведений Коха, Дригальского и штриховых посевов заключается в том, что они создают изолированные колонии микроорганизмов, которые при инокуляции на другую питательную среду превращаются в чистую культуру.

Выделение чистой культуры аеробних микроорганизмов состоит из ряда этапов.

В первый день (1 этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Его изучают за внешним видом, консистенцией, цветом, запахом и другим признаками, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. В некоторых случаях (острая гонорея, чума) на этом этапе можно поставить предыдущий диагноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеваться материал. Занял проводят бактериологической петлей (применяется чаще всего), с помощью шпателя за методом Дригальского, ватно-марлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 год. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов.

Однако, порой с целью нагромождения материала его засевают на жидкие питательные среды.

На второй день (2 этап исследования) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств.

Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. При потребности исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. Структуру колоний исследуют в проходном свете при малом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалинови, зернистые, нитевидные или волокнистые, которые характеризуются наличием переплетенных нитей в толще колоний.

Характеристика колоний – важна составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.

Характеризовать колонии можно за разными признаками. За величиной (диаметром) их разделяют на больших (4-6 мм и больше), средних (2-4 мм), мелких (1-2 мм), карликовых или точечных (меньше 1 мм). Форма колоний может быть самой разнообразной: правильно круглая, неправильная (амебоподибна), ризоидна. Они бывают прозрачными, что пропускают светло, и мутными.

За рельефом и контуром формы в вертикальном разрезе колонии разделяются на плоских, выпуклых, куполообразных, краплеподибни, конусообразные, плоскоопукли, плоские, что стелются по поверхности среды, с вдавленным центром, из припиднятою в виде соска серединой.

Поверхность колоний может быть матовой или блестящей, с глянцем, сухой или влажной, гладкой и блестящей или шершавой. Гладкие и блестящие колонии помечают как S-формы (smooth –гладкий и блестящий), а шершавые – R-формы (rough – шершавый, неравный).

Форма шершавых поверхностей также может быть разнообразной: морщинистой, гирозной, бородавчатой, шагреневой, иметь радиальную исчерченность и тому подобное.

Подавляющее большинство микроорганизмов образуют бесцветные колонии или мутно молочного цвета. Однако некоторые из них формируют цветные колонии. Их цвет определяется пигментом, который синтезируют бактерии: белые, кремовые, желтые, золотистые, синие, красные и тому подобное.

При доторканни к колонии петлей можно определить ее консистенцию: пастообразная, вязкая или слизистая, сухая, хрупкая и тому подобное.

Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают за методом Грамма для изучения морфологических и тинкториальних свойств возбудителей, исследуют подвижную бактерий в “висячей” или “раздавленой” капле. Эти признаки имеют чрезвычайно большое диагностическое значение при характеристике отдельных видов микроорганизмов.

Остатки исследуемых колоний осторожно, не касаясь других, снимают из поверхности среды и засевают на скошенный агар или на секторы чашки Петри с питательной средой для получения чистой культуры. Пробирки или чашки с  посевами помещают в термостат при оптимальной температуре на 18-24 год.

Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться стандартными сухими питательными средами, которые выпускает микробиологическая промышленность. Такие среды позволяют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их.

На жидких питательных средах бактерии также могут расти по-разному, хотя особенности проявлений роста более бедны, чем на плотных.

Бактерии способны вызывать диффузное помутнение среды, цвет его при этом может не изменяться или приобретает цвет пигмента. Такой характер роста чаще всего наблюдается в большинстве факультативно анаэробных микроорганизмов.

Порой происходит образование осадка на дне пробирки. Он может быть крошкообразным, гомогенным, вязким, слизистым и др. Среда над ним может оставаться прозрачной или становиться мутной. Если микробы пигмента не образуют, осадок имеет сирувато-билий или желтоватый цвет. Подобным чином растут, как правило, анаэробные бактерии.

Пристеночный рост проявляется образованием хлопьев, зерен, прикрепленных к внутренним стенкам пробирки. Среда при этом остается прозрачной.

Аеробные бактерии имеют тенденцию к поверхностному росту. Часто образуется нежная бесцветная или голубоватая пленка в виде едва заметного налета на поверхности, которая исчезает при стряхивании или взбалтывании среды. Пленка может быть влага, толстая, иметь вязанку, слизистую консистенцию и прилипать к петле, тянется за ней. Однако, встречается и плотная, сухая, хрупкая пленка, цвет которой зависит от пигмента, который производится микроорганизмами.

В случае необходимости изготовляется мазок, окрашивается, исследуется под микроскопом, а микроорганизмы засеваются петлей на поверхность плотной питательной среды для получения изолированных колоний.

На третий день (3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.

Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его за методом Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних (способность краситься) свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже за внешним видом и особенностями их роста можно сделать вывод о виду выделенных возбудителей. Определение вида бактерий за их морфологическими признаками называется морфологической идентификацией. Определения вида возбудителей за их культуральными признаками называют культуральной идентификацией.

Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виду выделенных микробов. Потому изучают биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны.

Чаще всего исследуют сахаролитические, протеолитические, пептолитические, гемолитические свойства, образования ферментов декарбоксилаз, оксидазы, каталазы, плазмокоагулазы, ДНК-азы,фибринолизина, восстановление нитратов в нитриты и тому подобное. Для этого существуют специальные питательные среды, которые засевают микроорганизмами (пестрый ряд Гисса, МПБ, свернутая сыворотка, молоко и др.).

 

Запомните этапы выделения чистых культур аеробних бактерий:

1 - макро- и микроскопическое изучение  исследуемого  материала  и посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний.

2 - макро- и микроскопическое изучение колоний и пересев их на скошенный агар для получения чистой культуры;

3 - проверка культуры на чистоту и ее идентификация;

4 - вывод о выделенной культуре.

9. Методы культивирования и идентификация анаэробов. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий.

Все микроорганизмы по типу дыхания разделяются на две основных группы: аеробни (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio сholerae и тому подобное) и анаэробные (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens и др.). Если материал, из которого следует выделить анаэробные возбудители, предварительно прогреть, а затем культивировать в анаэробных условиях, то вырастут именно эти бактерии.

Выделение чистой культуры анаэробных бактерий

В лабораторной практике часто придется работать с анаэробными микроорганизмами. Они более прихотливы к питательным средам, чем аэробы, чаще нуждаются в специальных ростовых добавках, требуют прекращения доступа кислорода при их культивировании, длительность роста их длиннее. Потому работа с ними более сложна, требует значительного внимания бактериологов и лаборантов.

Важной является защита материала, который содержит анаэробные возбудители от токсичного влияния атмосферного кислорода. Потому материал из очагов гнойной инфекции рекомендуется забирать во время их пункции с помощью шприца, время между взятием материала и посевом его на питательную среду должно быть максимально коротким.

Поскольку для культивирования анаэробных бактерий используют специальные питательные среды, которые не должны содержать кислорода и имеют низкий окислительно восстановительныйпотенциал (-20 -150 мВ), к их составу вводят индикаторы – резазурин, метиленовий синей и тому подобное, которые реагируют на смену этого потенциала. При его росте возобновлены бесцветные формы индикаторов изменяют свой цвет: резазурин окрашивает среду в розовый цвет, а метиленовий синей – в голубой. Такие изменения свидетельствуют о невозможности использования сред для культивирования анаэробных микробов.

Способствует снижению окислительно восстановительного потенциала введения в среду не меньше 0,05 % агару, который, увеличивая его вязкость, способствует уменьшению поступления кислорода. Это, в свою очередь, достигается еще и использованием свежих (не позже двух часов после изготовления) и редуцируемых питательных сред.

Следует учесть, что через особенности бродильного типа метаболизма анаэробных бактерий они требуют более богатых на питательные компоненты и витамины сред. Чаще всего используют сердечно мозговой и печеночный настои, соевые и дрожжевые экстракты, гидролитичний перевар казеина, пептон, триптон. Обязательным является добавление факторов росту, таких как твин-80,гемин, менадион, цельная или гемолизированная кровь.

 

Методы создания анаэробных условий. Учитывая, что свободный молекулярный кислород является токсичным для облигатно-анаэробных бактерий, обязательным условием культивирования таких микроорганизмов является ограничение его доступа. Существует ряд методов (механических, физических, биологических), которые позволяют это обеспечить.

Физические методы. 1. Перед посевом бактерий на питательную среду его обязательно регенерируют для удаления избытка растворенного кислорода. С этой целью среду кипятят в течение 15-20мин на водяной бане, а затем быстро охлаждают к необходимой температуре.

2. Для предупреждения проникненя кислорода в среду его заливают слоем стерильного вазелинового масла или парафином.

3. Столбик питательной среды в пробирках должен быть достаточно высоким (10-12 см). Кислород, как правило, дифундирует в толщу столбика на глубину до 2 см, потому ниже создаются благоприятные условия для культивирования анаэробных микробов.

4. Эвакуационно заместительный метод заключается в использовании анаэростатов. Они представляют собой герметические металлические или пластмассовые банки, из которых можно выкачать кислород и заменить его инертным газом (гелий, азот, аргон). Допускается использование трехкомпонентной газовой смеси, которая состоит из 80 % азота, 10 % диоксиду углерода и 10 % водорода. Порой допустимым считается использование природного газа. Для поглощения кислорода, который остается в анаэростате, используют палладиевые катализаторы. С целью поглощения водяной пары используют хлорид кальция, силикагель и тому подобное, которые помещают на дно анаеростата.

Химические методы. 1. Использование веществ, способных поглощать кислород. С этой целью допустимым является применение щелочного раствора пирогаллола. При этом учитывают поглощающую активность вещества: на 100 мл емкости герметического сосуда, в котором находятся чашки Петри, используют 1 г пирогаллола и 10 мл 2,5 N раствора гидроксида натрия.

Кислородосвязывающий эффект имеет также гидросульфит натрия (Na2S2O4). Для связывания кислорода в 1 л воздуха используют смесь, которая состоит из 100 мл свежего 20 % растворуNa2S2O4 и 16 мл 50 % гидроксида калия.

2. Применение веществ-редуцентов. Учитывая, что рост облигатно-анаэробных бактерий происходит в средах с низким уровнем окислительно восстановительного потенциала, к ним добавляются специальные восстановители: цистеин (0,03-0,0,5 %), тиогликолевую кислоту или тиогликолат натрия (0,01-0,02 %), сульфид натрия, аскорбиновую кислоту (0,1 %), разнообразные сахара.

Функции обновителей могут выполнять кусочки паренхиматозних органов животных (печенка, почки, сердце) или даже растений (картофель, другие корнеплоды).

Степень поглощения кислорода или степень возобновления среды измеряют или электрометрически или с помощью индикаторов (резазурин, нейтральный красный, феносафранин).

3. Использование специальных газогенерирующих систем, которые позволяют создать бескислородные условия в микроанаеростатах, транспортных пластиковых пакетах и тому подобное. Одной из самых распространенных есть система “Gas Generating Box”. В ее состав входят химические генераторы водорода (борогидрит натрию) и углекислого газа (таблетки бикарбоната натрия и лимонной кислоты), а также палладиевый катализатор, который поглощает кислород.

Чашки с посевами помещаются в микроанаеростат, на дне которого находится слой палладиевого катализатору. Кончик пакета “Gas Generating Box” надрезают ножницами, и у него наливают 10-15мл воды. Пакет располагают в микроанаеростати. Через 15-20 мин в нем создаются анаэробные условия. Водород, который выделяется, взаимодействует с кислородом, образовывая воду, а углекислота продуцируется при взаимодействии бикарбоната натрия с лимонной кислотой. 

Биологические методы. 1. Метод Фортнера. Метод заключается в совместном культивировании на одной среде аэробних и анаэробных микроорганизмов. Сначала по диаметру чашки вырезаютполоску агару шириной до 0,5-1,0 см. С одной стороны засевают исследуемый материал, что содержит анаэробные возбудители, а из другого – микробы, которые являются индикатором анаэробных условий (Serratia marcescens или “чудесная палочка”). Края чашки парафинируют или закрывают пластилином. Через некоторое время на поверхности среды вырастают колонии как аэробных, так и анаэробных микробов. При поглощении кислорода Serratia marcescens дает рост бледно-розовых или бесцветных колоний, а при нарушениях герметичности – ярко-красные. На другой половине чашки вырастают колонии анаэробных микробов.

2. Метод Хеннеля (“часовых стекол”). Он является своеобразной модификацией предыдущего. Материал, который содержит анаэробные возбудители, засевается на поверхность питательной среды диаметром 2-2,5 см. Сверху он покрывается “часовым стеклом”, заполненным слоем МПА и засеяным Serratia marcescens. Аеробни микробы, поглощая кислород, создают условия для благоприятного роста анаэробных возбудителей.

В высоко специализированных лабораториях пользуются специальной анаэробной техникой, которая включает использование питательных сред без кислорода с обновителями, выполнения посевов и пересеваний в атмосфере инертных газов, углекислоты и тому подобное.

За последние годы созданы стационарные анаэробные боксы, которые содержат все необходимое для создания анаэробных условий культивирования, включая термостаты. Как правило, такие камеры заполняются трикомпонентною газовой смесью. Бактериолог работает в камере, находясь внешне, применяя резиновые рукавицы, вмонтированные у нее. Такое оборудование имеет неопровержимые преимущества, которые заключаются в том, что полностью исключается контакт кислорода с исследуемым материалом.

 

Выделение и идентификация анаэробных микроорганизмов

 

Учитывая современное развитие микробиологической науки, выделять и идентифицировать культуры анаэробных микроорганизмов можно аналогично аеробним бактериям. Обязательным при этом есть соблюдение на всех этапах исследования условий анаэробиоза, используя для этого трикомпонентну газовую смесь (в определенном соотношении азот, водород и углекислый газ) или систему “Gas Generating Box”.

Однако возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции можно выделять и идентифицировать за другой схемой.

На первом этапе (И день исследования) изучают макроскопические особенности клинического материала, делают мазок и окрашивают его за методом Грама. После этого материал засевают на среду Китта-Тароцци и молоко. Предварительно среду регенерируют на кипящей водяной бане в течение 10-20 мин и охлаждают. Непосредственно после посева материала среду нагревают на водяной бане при 80°С в течение 20 мин для уничтожения вегетативных неспоровых форм микробов. Среды ставят в термостат и при температуре 37 °С культивируют 1-3 сутки.

На втором этапе изучают проявления роста микроорганизмов (помутнение, образование осадка и газа на среде Китта-тароцци, пептонизация молока). Поскольку среда Китта-тароцци сверху залита слоем вазелинового масла для предотвращения доступа кислорода, у него окунают пастеровскую пипетку, набирают жидкость, из которой готовят мазок, крася его за методом Грамма. Под микроскопом в мазке можно видеть большие граммположительные палочкоподобные бактерии. После этого проводят занял материалу за методами Вейнберга или Цейсслера для получения изолированных колоний.

За методом Вейнберга готовят несколько узких высоких пробирок (3-4) с растопленным и охлажденным до 42-45 °С сахарным м’ясо-пептонним агаром. Возможно использование среды Вильсон-блера. Материал из среды Китта-тароцци вносят в первую пробирку с помощью пастеровской пипетки и тщательным образом перемешивают, потом переносят в друге, а дальше – в третью. Для застудневания агара их быстро охлаждают под струей холодной водопроводной воды. За счет этого живые микробные клетки фиксируются в определенных участок агара. После застывания агара пробирки культивируют при оптимальной температуре в течение 1‑2 суток для образования изолированных колоний.

 

Колонии по Вейнбергу

 

Содержание каждой пробирки можно, кроме того, всосать в пастеровские пипетки или трубки Виньяль-Вейона, следя, чтобы не было пузырьков воздуха. Последние имеют длину возле 30 см и диаметр 0,5-0,6 см. Верхний конец их, который закрывается ватой, имеет перетяжку, а нижний вытянут в виде капилляра. После заполнения пипетки ее вытянутый конец запаивают и кладут в термостат для культивирования. Через 1-2 сутки в агаре вырастают колонии анаэробных бактерий. Для того, чтобы их изолировать, трубку надрезают напильником на определенном уровне, разламывают, колонию берут бактериальной петлей или иглой, переносят в соответствующую среду.

Для выделения изолированных колоний за методом Цейсслера материал из среды Китта-тароцци или молока наносят петлей или 1-2 капли пастеровской пипеткой на чашку Петри с сахарно-кровяным агаром и делают посев шпателем за методом Дригальского. Не стерилизуя шпатель, засевают вторую чашку, а затем и третью. Чашки переворачивают вверх дном, подписывают, ставят ванаеростат, в котором создают анаэробные условия, а затем – в термостат при температуре 37 °С на 2-3 сутки. На последней чашке вырастают изолированные колонии.

Третий этап исследования начинается с изучения морфологических особенностей колоний, которые выросли в чашках Петри или трубках Виньяль-вейона. Исследуются их форма, величина, цвет, характер краев, рельеф колонии, консистенция и тому подобное. Из колоний готовят мазки, красят их за методом Грама. После этого колонии отсевают в среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры. Посевы инкубируют определенное время при оптимальной температуре.

На четвертом этапе обращают внимание на особенности роста чистой культуры возбудителей на соответствующих средах, проверяют ее на чистоту и проводят идентификацию. Идентифицируют выделенные чистые культуры анаэробных микроорганизмов подобно аеробних за морфологическими, культуральными, биохимическими и биологическими признаками. Обязательно используют определение токсигенних свойств возбудителей в биологичниий пробе и реакции нейтрализации на лабораторных животных. В некоторых случаях определяют антигенные свойства микроорганизмов.

Таким образом, на основании изучения разнообразных свойств микроорганизмов делается вывод о принадлежности их к тому или другому виду.

Среды для культивирования анаэробных микроорганизмов

Среду Китта-Тароцци готовят на основе бульйона Хоттингера, к которому добавляют кусочки бычьей печенки или мяса. Стерилизуют его при 1 атмосфере в течение 30  мин. Активная реакция среды – 7,4-7,6. После посева материала среду заливают сверху слоем вазелинового масла толщиной до 1 см.

Анаэробный кровяной агар готовят на основе еритрит-агара. В его состав входят также специальные добавки: среда 199 (10 %), гемин (10 мкг/мл), твин-80 (0,1 %), метадион (10 мкг/мл), цитратнакровь (до 5 %) и тому подобное. После стерилизации его разливают в чашки Петри. Используют не позже, как через 2 год после изготовления.

Желтковый агар. В растопленную и охлажденную до 56-60 °С среду на основе еритрит-агара добавляют суспензию куриного желтка (20 %), глюкозу (0,2 %), гемин (10 мкг/мл) и разливают в чашки Петри. Среду используют для определения лецитиназнои активности возбудителей, в частности C. perfringens. При наличии лецитиназы вокруг колоний образуются зоны помутнения.

Коммерческая среда для контроля стерильности. Его можно использовать в качестве транспортное. Для улучшения роста анаэробных бактерий к его составу можно вводить специальные добавки, такие как среда 199, гемин, твин-80, метадион, цитратна кровь и тому подобное.

Среда Вильсон-блера. Его готовят на основе растопленного и охлажденного до 60 °С 1 % сахарного (глюкоза) МПА рН 7,4 с добавлением на 100 мл 10 мл стерильного 20 % раствору сульфита натрия и 1 мл 8 % раствору хлорида железа. Готовую среду не стерилизуют.

Его используют для ускоренной диагностики газовой анаэробной инфекции, вызванной Clostridium рerfringens. Уже через 1-2 год наблюдают изменение среды: оно чернеет в результате возобновления сульфита натрия в сульфат, который взаимодействует с хлоридом железа, образовывая сульфид железа. Появляются также разрывы агара в результате интенсивного газообразования.

Лакмусовое молоко. Готовят среду из свежего молока. Предварительно его кипятят и оставляют в прохладном месте на одни сутки. Снимают верхний слой жира и процедуру повторяют. Молоко фильтруют, и 10 % раствором бикарбоната натрия доводят рН до 7,2. Перед стерилизацией к молоку добавляют 5-10 % лакмусовой настойки и идентичное количество 10 % раствору бикарбоната натрия, чтобы пена молока приобрела сине-фиолетовый оттенок. При пидлужуванни молока оно становится сине-фиолетовым, при пидкислюванни – розовым вплоть до красного.

10. Методы промышленного культивирования бактерий.

Для осуществления любого биотехнологического процесса необходимы:

- культура микроорганизмов;

- питательная среда;

- аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций;

- средства контроля и управления процессом.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства препаратов. На стадии культивирования осуществляется накопление как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроор-

ганизмов. Так, при производстве бактериальных препаратов целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продукты, синтезируемые клеткой, – антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную смесь.

В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма, способ культивирования называют поверхностным.

Когда же микроорганизмы распределяются по всему объему жидкой питательной среды, культивирование называют глубинным (жидкофазным). В таком случае кислород поступает к клеткам в результате интенсивной операции перемешивания.

Последний способ наиболее широко применяется в настоящее время в производстве большинства препаратов по следующим причинам:

1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в условиях состояния покоя количество микробов не превышает 1-2 млрд/см-3, а при применении принудительной аэрации урожайность достигает 50-60 млрд/см-3.

2. Процесс легко управляем. С целью длительного поддержания роста и размножения микроорганизмов в процессе их культивирования дополнительно вводят углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста.

Данный способ также позволяет легко корректировать рН среды в процессе культивирования.

3. Процесс максимально технологичен.

Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в реакторах (ферментерах) складывается из следующих этапов:

- отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними;

- приготовление посевной микробной культуры;

- приготовление и стерилизация питательных сред;

- подготовка биореактора к посеву;

- выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль над процессом культивирования.

Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций:

- стерилизацию оборудования и коммуникаций;

- приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др.

Остановимся на каждом из этапов культивирования.

Эталонные штаммы микроорганизмов хранятся и поддерживаются на заданном уровне во ВГНИКИ (Всесоюзный государственный научно-исследовательский институт клеточной инженерии) ветеринарных препаратов. Эти штаммы, в свою очередь, являются производственными, поскольку на их основе готовятся вакцины.

Наряду с производственными и эталонными штаммами во ВГНИКИ хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки качества вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетически однородными популяциями микроорганизмов со стабильными морфологическими, специфическими и биологическими свойствами. Основными требованиями к этим штаммам являются их высокие антигенные и иммуногенные свойства.

Производственные, эталонные штаммы должны сохранять

генетическую стабильность антигенных, иммуногенных и дру-

гих присущих им биологических свойств на протяжении 10-20

последовательных пересевов как in vivo, так и in vitro.

Обычно производственное культивирование микроорганизмов осуществляется в больших объемах. Поэтому вначале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, находящегося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ампуле, делают посевы в небольшие емкости, например, во флаконе емкостью 100-200 см3, заполненные по 50-150 мл производственной средой. Затем из флаконов делают высевы в большие емкости (бутыли объемом 18-20 л). При хорошем накоплении микроорганизмов такую культуру вносят в реактор и называют посевной (маточной) культурой. При этом нужно предварительно рассчитать необходимое количество посевной культуры для производственного культивирования микроорганизмов исходя из посевной дозы, которая обычно составляет от 1 до 10% по объему. Посевные микробные культуры также контролируются на сохранение ими типичных морфологических, культурально-биохимических, антигенных и иммуногенных свойств, а также на отсутствие в них посторонней микрофлоры (ПМФ).

11. Международная классификация и характеристика ферментов микроорганизмов.

Ферменты, образу­емые бактериальной клеткой, могут локали­зоваться как внутри клетки — эндоферменты,так и выделяться в окружающую среду — экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь ис­точниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепля­ют крупные молекулы пептидов, полисаха­ридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализо­ваны в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в про­цессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и — в некоторых слу­чаях — для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности поль­зуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзофермен­тов можно определить при помощи диффе­ренциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.

По типу катализируемых реакций ферменты подразделяются на 6 классов согласно иерархической классификации ферментов (КФ, EC — Enzyme Comission code). Классификация была предложена Международным союзом биохимии и молекулярной биологии (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Каждый класс содержит подклассы, так что фермент описывается совокупностью четырёх чисел, разделённых точками. Например, пепсин имеет название ЕС 3.4.23.1. Первое число грубо описывает механизм реакции, катализируемой ферментом:

• КФ 1: Оксидоредуктазы, катализирующие окисление или восстановление. Пример: каталаза, алкогольдегидрогеназа.

• КФ 2: Трансферазы, катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата на другую. Среди трансфераз особо выделяют киназы, переносящие фосфатную группу, как правило, с молекулы АТФ.

• КФ 3: Гидролазы, катализирующие гидролиз химических связей. Пример: эстеразы, пепсин, трипсин, амилаза, липопротеинлипаза.

• КФ 4: Лиазы, катализирующие разрыв химических связей без гидролиза с образованием двойной связи в одном из продуктов.

• КФ 5: Изомеразы, катализирующие структурные или геометрические изменения в молекуле субстрата.

• КФ 6: Лигазы, катализирующие образование химических связей между субстратами за счёт гидролиза АТФ. Пример: ДНК-полимераза.

Будучи катализаторами, ферменты ускоряют как прямую, так и обратную реакции, поэтому, например, лиазы способны катализировать и обратную реакцию — присоединение по двойным связям.

12. Роль ферментов в идентификации бактерий. Методы определения гликолитических и протеолитических ферментов бактерий. Дифференциально-диагностические среды (моносубстратные и полисубстратные).

Идентификация бактерий по фер­ментативной активности.

Наиболее ча­сто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз, используя специальные методы и среды.

Для определения протеолитической активности мик­роорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Че­рез 3—5 дней посевы просматривают и отмечают харак­тер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты — индол, сероводород, аммиак. Для их опреде­ления служат специальные индикаторные бумажки, ко­торые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разло­жения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку.

Для многих микроорганизмов таксономическим при­знаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продук­тов. Для выявления этого используют среды Гисса, со­держащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, маль­тозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2—6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».

Для обнаружения газообра­зования в жидкие среды опускают поплавки или исполь­зуют полужидкие среды с 0,5% агара.

Для того чтобы оп­ределить интенсивное кислотообразование, характерное для брожения смешанного типа, в среду с 1% глюкозы и 0,5% пептона (среда Кларка) добавляют индикатор метиловый красный, который имеет желтый цвет при рН 4,5 и выше, и красный —при более низких значениях рН.

Гидролиз мочевины определяют по выделению ам­миака (лакмусовая бумажка) и подщелачиванию среды.

При идентификации многих микроорганизмов исполь­зуют реакцию Фогеса — Проскауэра на ацетоин — проме­жуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свиде­тельствует о наличии бутандиолового брожения.

Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешива­ния микробных клеток с 1 % раствором перекиси водоро­да.

Для определения цитохромоксидазы применяют ре­активы: 1) 1% спиртовый раствор сс-нафтола-1; 2) 1% водный раствор N-диметил-р-фенилендиамина дигидро-хлорида. О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появ­ляющемуся через 2—5 мин.

Для определения нитритов используют реак­тив Грисса: По­явление красного окрашивания свидетельствует о нали­чии нитритов.

Дифференциально-диагностические среды — специальные смеси питательных веществ, применяемые для определения видовой принадлежности микробов и изучения их свойств. При росте бактерий на дифференциально-диагностических средах протекают химические процессы, обусловленные наличием у микробной клетки различных ферментов. Одни из них способны расщеплять белки, другие —углеводы, третьи — вызывать реакции окисления и восстановления и т. д. Благодаря действию ферментов в дифференциально-диагностической среде происходят соответствующие изменения. Дифференциально-диагностические среды можно разделить на четыре основные группы.

1. Среды, содержащие белок и выявляющие способность микробов расщеплять белки (протеолитические Свойства): мясо-пептонная желатина «столбиком», свернутая лошадиная или бычья сыворотка, молоко, кровяной агар. При посеве бактерий проколом в мясо-пептонную желатину, «столбиком» в случае расщепления белка наблюдают разжижение среды. При посеве на среду со свернутой сывороткой расщепление белка определяют по разжижению среды и образованию углублений на ее поверхности. Расщепление микробом молока выявляется просветлением или растворением первоначально свернувшегося молока. Наличие гемолитической активности исследуемой культуры проверяют посевом ее в чашку Петри на специальный кровяной агар. В результате разрушения эритроцитов вокруг колоний (например, гемолитического стрептококка или стафилококка) образуются зоны просветления. 2. Среды для выявления способности микробов расщеплять углеводы и высокоатомные спирты (Эндо среда, Левина среда, Расселла среда, Дригальского — Конради среда, Рапопорт — Вайнтрауба среда, Шустовой среда). Для выявления этих свойств микроорганизмов применяют также «пестрый» ряд, т. е. серию пробирок, содержащих питательные среды, включающие различные углеводы, многоатомные спирты и индикатор. В качестве индикаторов пользуются лакмусовой настойкой или бромтимоловым синим. Разложение какого-либо из углеводов с образованием кислоты выявляют по изменению цвета индикатора, образование газа— по заполнению газом и всплыванию специального стеклянного поплавка в жидкой среде. Или применяют полужидкие Гисса среды (см.) с 0,5% агара с соответствующими сахарами и индикатором Андраде. После посева микроба на эти среды образование кислоты выявляют покраснением среды, а образование газа — по появлению его пузырьков в агаре или по разрыву и сдвигу вверх агарового столбика. К дифференциально-диагностическим средам  второй группы относят также крахмальный агар, служащий для определения способности микробов расщеплять крахмал, среду Кларка и др. 3. Среды, на которых выявляется способность микробов обесцвечивать красители, добавленные к бульону: метиленовый синий, тионин, лакмус, индигокармин, нейтральный красный или другие (среда Ротбергера, среда Омелянского). К третьей группе относят также среды с нитратами, служащие для определения способности микробов восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты) и далее в аммиак или свободный азот. 4. Среды, выявляющие способность микробов усваивать вещества, которые не усваиваются другими микробами, например среда с лимоннокислым натрием (цитратный агар Симонса) для отличия кишечной палочки, которая лишена способности ассимилировать эту среду, от других бактерий кишечной группы или среда с олеиновокислым натрием для дифференциации дифтерийной палочки от ложно дифтерийной и дифтероидов (агар Энжеринга). К дифференциально-диагностическим средам относят также среды для дифференциации анаэробов, теллуритовые среды для дифференциации дифтерийных бактерий, среды с мочевиной, щелочные среды (Дьедонне агар) для культивирования холерного вибриона и др. См. также   Идентификация микробов.

13. Механизмы действия физических факторов на микроорганизмы (температура, давление, высушивание, свет, ультразвук, радиация).

К числу основных физических факторов, воздействующих на микроорганизмы как в естественной среде обитания, так и в условиях лаборатории, относят температуру, свет, электричество, высушивание, различные виды излучения, осмотическое давление и др.

Температура. О влиянии температуры на микроорганизмы судят по их способности  расти и размножаться в определенных температурных границах. Для каждого вида микроорганизмов определена оптимальная температура развития. В зависимости от пределов этой температуры бактерии разделены на три физиологические группы:

·        Психрофильные микроорганизмы (психрофилы) – способны расти и размножаться от 0⁰С до 30…35⁰С, а температурный оптимум составляет 15…20⁰С. Среди представителей этой группы обитатели северных морей, почвы, сточных вод.

·        Мезофильные бактерии – способны расти и размножаться при температуре от 10⁰С до 40…45⁰С, температурный оптимум – 30…37⁰С. Наиболее обширная группа микроорганизмов, в нее включают большинство сапрофитов и  все патогенные микроорганизмы.

·        Термофильные бактерии – способны расти и размножаться в температурных границах от 35⁰С до 70…75⁰С, температурный оптимум – 50…60⁰С. Микроорганизмы этой группы довольно часто встречаются в природе: почве, воде, теплых минеральных источниках, пищеварительном  тракте животных и человека

·        Экстремально-термофильные бактерии – способны существовать при температурах от 40 до 93⁰С и выше. Возможность существования при высоких температурах обусловлена особым составом липидных компонентов клеточных мембран, высокой термостабильностью белков, ферментов и клеточных структур.

Высокие и низкие температуры по-разному влияют на микроорганизмы. При низких температурах клетка переходит в состояние анабиоза, в котором она может существовать длительное время. Так, эшерихии сохраняют жизнеспособность при -190⁰С до 4 месяцев, возбудитель листериоза при -10⁰С до 3 лет. Низкие температуры приостанавливают гнилостные и бродильные процессы. На этом принципе основано сохранение продуктов в холодильниках.

Высокая температура губительно действует на микробы. Чем выше температура, тем меньшее время необходимо для инактивации микроорганизмов. В основе бактерицидного действия высоких температур лежит разрушение ферментов за счет денатурации белков и нарушения осмотического барьера.

Разные виды микроорганизмов обладают различной устойчивостью к высоким температурам, значительно отличается устойчивость спор и вегетативных клеток. Так большинство вегетативных форм патогенных микроорганизмов гибнут при температуре 80…100⁰С в течение 1 минуты, а споры возбудителя сибирской язвы выдерживают кипячение более 1 часа.

Действие видимого излучения (света).

Видимый (рассеянный свет), имеющий длину волны 300…1000 нм, обладает способность угнетать рост и жизнедеятельность большинства микроорганизмов. В связи с этим культивирование микроорганизмов осуществляют в темноте. Видимый свет положительно влияет только на бактерии, которые используют свет для фотосинтеза.

Прямые солнечные лучи действуют на микроорганизмы более активно, чем рассеянный свет. Бактерицидное действие света связано с образованием гидроксильных радикалов и других высокореактивных веществ, разрушающих вещества, входящие в состав клетки. Например, происходит инактивация ферментов.

Микроорганизмы-сапрофиты более устойчивы к воздействию света, чем патогенные. Это объясняется тем, что они, чаще подвергаясь действию прямых солнечных лучей, более адаптированы к ним. В связи с этим следует отметить большую гигиеническую роль солнечного света. Именно под воздействием солнечного излучения происходит самоочищение воздуха, верхних слоев почвы и воды.

Ультрафиолетовое излучение.

Ультрафиолетовое излучение с длиной волны 295…200 нм является бактерицидно активным, то есть способным губительно действовать на микроорганизмы. Механизм действия ультрафиолетового излучения заключается в его способности частично или полностью подавлять репликацию ДНК и повреждать рибонуклеиновые кислоты (особенно мРНК).

Ультрафиолетовое излучение широко применяют для санации воздуха в животноводческих помещениях, в лабораториях, в промышленных цехах, микробиологических боксах. Для дезинфекции воздуха промышленность выпускает различные лампы. В животноводческой практике широко применяют установки ИКУФ-1, как источник ультрафиолетового и инфракрасного излучения.

Ионизирующее излучение.

Ионизирующее (рентгеновское) излучение представляет собой электромагнитное излучение с длиной волны 0,006…10нм. В зависимости от длины волны различают гамма-излучение, бета-излучение и альфа-излучение. Наиболее активным действие на биологические объекты отличается гамма-излучение, но даже его бактерицидные свойства значительно ниже, чем бактерицидные свойства ультрафиолетового излучения. Гибель бактерий наступает только при облучении их большими дозами от 45000 до 280000 рентген. Отдельные виды способны выживать в воде атомных реакторов, где величина радиоактивного облучения достигает 2…3 млн. рентген. Более того, получены данные, что воздействие небольших доз  гамма-излучения на патогенные микроорганизмы, способны усилить их вирулентные свойства.

Механизм действия рентгеновского излучения заключается в поражении ядерных структур, в частности нуклеиновых кислот цитоплазмы, что приводит к гибели микробной клетки или изменению ее генетических свойств (мутации).

Электричество.

Электрический ток малой и высокой частоты уничтожает микроорганизмы. Особенно сильным бактерицидным действием обладают токи ультравысокой частоты. Они приводят в колебание молекулы всех элементов клетки, вследствие чего происходит быстрое и равномерное нагревание всей массы клетки не зависимо от температуры окружающей среды. Кроме того, установлено, что длительное воздействие токов высокой частоты приводит к электрофорезу некоторых компонентов питательной среды. Образующиеся при этом соединения инактивируют микробную клетку.

Ультразвук.

Механизм бактерицидного действия ультразвука (волны с частотой 20 000 Гц) заключается  в том, что в цитоплазме микроорганизмов, находящихся в жидкой среде, образуется кавитационная полость, которая заполняется парами жидкости, в пузырьке возникает давление, что приводит к дезинтеграции цитоплазматических структур. Ультразвук используют для стерилизации пищевых продуктов и дезинфекции предметов.

Аэроионизация.

Аэроионы, несущие положительный или отрицательный заряд, возникают в воздухе при искусственной или естественной ионизации. Наибольшее влияние на бактерии оказывают отрицательно заряженные ионы, действуя уже в средних концентрациях (5*10⁴ в 1 см³ воздуха). Положительно заряженные ионы обладают менее выраженным бактерицидным действием, они способны задерживать рост и развитие микроорганизмов только в больших концентрациях (10⁶ в 1 см³ воздуха). Сила действия аэроионов зависит от их концентрации, длительности экспозиции и расстояния от источника. Используют аэроионы для обеззараживания воздуха жилых помещений, цехов предприятий, медицинских учреждений.

Почти все факторы физического воздействия на микроорганизмы могут быть использованы с целью стерилизации. Стерилизация – уничтожение патогенных и непатогенных микроорганизмов, их вегетативных и споровых форм в каком-либо объекте. Стерилизации подвергают питательные среды, стеклянную посуду, инструменты, перевязочный материал, халаты. Стерилизации также подвергают воздух и предметы в микробиологических боксах.

Механизм действия различных методов стерилизации не одинаков, но в основе каждого лежит способность нарушать жизненные процессы микробной клетки (денатурация белков, угнетение функции ферментных систем).

             Физические методы стерилизации:

1.    Прокаливание (фламбирование). Подвергаются металлические предметы (петли, иглы, скальпель, ножницы, шпатель).

2.    Стерилизация путем кипячения. Кипячением стерилизуют иглы, шприцы, пинцеты, ножницы, скальпели и другие инструменты, которые раскладывают в стерилизаторах на решетчатые вставки. В стерилизатор наливают дистиллированную воду в количестве, достаточном для полного закрывания инструментов. В воду можно добавлять 2% гидрокарбоната натрия. Кипятят в течение 25 – 30 минут.

3.    Стерилизация сухим жаром. Стерилизация осуществляется при помощи сухого нагретого воздуха в сушильном шкафу с двойными стенками (печь Пастера). Снаружи шкаф облицован теплонепроницаемым материалом. Контроль температурного режима осуществляется при помощи температурного датчика. В сушильном шкафу стерилизуют чистую, предварительно высушенную стеклянную посуду, завернутую в пергаментную бумагу. Режимы стерилизации: 155…160⁰ –    2 часа; 165…170⁰ – 1…1,5 часа; 180⁰ – 1 час. Время экспозиции отмечают от момента достижения температурой заданного значения.

4.    Стерилизация текучим паром. Стерилизацию проводят в аппарате Коха, который представляет собой сосуд с неплотно закрытой крышкой. На дне аппарата имеется решетчатая подставка, до уровня которой наливают воду. На подставку помещают сосуд с решетчатым дном, в котором находятся объекты, подлежащие стерилизации (питательные среды). В процессе кипения воды образуются пары, нагревающие содержимое сосуда. Время стерилизации – 30…40 минут. Однократная стерилизация уничтожает только вегетативные формы бактерий, а споры сохраняют свою жизнеспособность, стерилизацию проводят «дробно» - три дня подряд. Таким способом стерилизуют среды с углеводами, молоко, среды с желатиной, то есть субстраты, которые не выдерживают нагревания более 100⁰С, длительного действия пара или сухого жара.

5.    Тиндализация – это дробная стерилизация в водяной бане при 56…58⁰С в течение 5…6 суток: в первый день прогревают в течение 2 часов, в последующие дни – по  1 часу. Метод используется для стерилизации материалов, разрушающихся при температуре выше 58…60⁰С – веществ, содержащих белки (сыворотка крови).

6.    Пастеризация – это метод не полной стерилизации, используемы с целью сохранения питательной ценности пищевого продукта, которая может снижаться при кипячении. Продукт нагревают при 80⁰С в течение 30 минут, а затем резко охлаждают до 4…8⁰С. Резкое охлаждение препятствует прорастанию спор и последующему размножению бактерий.

7.    Стерилизация паром под давлением (автоклавирование). Это самый эффективный метод стерилизации. Принцип стерилизации основан на том, что чистый насыщенный водяной пар при высоком давлении, конденсируясь, повышает температуру внутри автоклава выше температуры кипения. При повышении давления пара соответственно повышается и температура в стерилизационной камере: 50,6 кПа (0,5 атм.) – 110…112⁰С, 101,3 кПа (1 атм.) – 120…121⁰С, 151,9 кПа (1,5 атм.) – 124…126⁰С, 202,6 кПа (2 атм.) – 132…133⁰С.  Конструкции и объем стерилизационной камеры автоклавов могут быть различными (горизонтальные и вертикальные), но принцип действия остается таким же. В автоклаве стерилизуют питательные среды, выдерживающие температуру выше 100⁰С, стеклянную посуду, завернутую в бумагу, перевязочный материал, халаты (в биксах). Кроме того, обеззараживают микробные культуры, отработанные питательные среды, посуду. Режимы работы автоклава нуждаются в постоянном контроле. Для этого используют химические и биологические методы.

8.    Стерилизация фильтрованием. Осуществляется пропускание материала через бактериологические фильтры. Фильтрация связана с механической задержкой бактерий мелкопористыми фильтрами и с адсорбционной способностью материала из которого изготовлен фильтр. Фильтрации обычно подвергают жидкости не выдерживающие нагревания. Различают фильтры:

·        керамические – их изготавливают из каолина или кварцевого песка;

·        асбестовые - фильтры Зейтца (пластины из смеси асбеста с целлюлозой);

·        мембранные – имеют вид тонких листков белой бумаги, их  готовят из гемицеллюлозы, обработанной соответствующими реактивами, температурой и прессованием. Эти фильтры различают по диаметру и величине пор, имеют наиболее точную калибровку.

Стерильность фильтратов контролируют высевом на питательные среды с термостатированием.

9.    Стерилизация ультрафиолетовым излучением. В лаборатории источником ультрафиолетового излучения обычно служат бактерицидные лампы, используемые для обеззараживания воздуха.

Стерилизация ультразвуком. С помощью ультразвука стерилизуют воду, молоко, некоторые продукты, кожевенное сырье. Стерилизующее действие ультразвука связано с разрушением бактериальной клетки под действием кавитационных полостей, возникающих в цитоплазме.

14. Методы стерилизации материала. Аппаратуры для стерилизации материалов (сухожаровые шкафы, автоклавы, стерилизаторы, фильтры). Контроль режима стерилизации (микробиологический метод, физический метод).

Физические методы стерилизации:

1.    Прокаливание (фламбирование). Подвергаются металлические предметы (петли, иглы, скальпель, ножницы, шпатель).

2.    Стерилизация путем кипячения. Кипячением стерилизуют иглы, шприцы, пинцеты, ножницы, скальпели и другие инструменты, которые раскладывают в стерилизаторах на решетчатые вставки. В стерилизатор наливают дистиллированную воду в количестве, достаточном для полного закрывания инструментов. В воду можно добавлять 2% гидрокарбоната натрия. Кипятят в течение 25 – 30 минут.

3.    Стерилизация сухим жаром. Стерилизация осуществляется при помощи сухого нагретого воздуха в сушильном шкафу с двойными стенками (печь Пастера). Снаружи шкаф облицован теплонепроницаемым материалом. Контроль температурного режима осуществляется при помощи температурного датчика. В сушильном шкафу стерилизуют чистую, предварительно высушенную стеклянную посуду, завернутую в пергаментную бумагу. Режимы стерилизации: 155…160⁰ –    2 часа; 165…170⁰ – 1…1,5 часа; 180⁰ – 1 час. Время экспозиции отмечают от момента достижения температурой заданного значения.

4.    Стерилизация текучим паром. Стерилизацию проводят в аппарате Коха, который представляет собой сосуд с неплотно закрытой крышкой. На дне аппарата имеется решетчатая подставка, до уровня которой наливают воду. На подставку помещают сосуд с решетчатым дном, в котором находятся объекты, подлежащие стерилизации (питательные среды). В процессе кипения воды образуются пары, нагревающие содержимое сосуда. Время стерилизации – 30…40 минут. Однократная стерилизация уничтожает только вегетативные формы бактерий, а споры сохраняют свою жизнеспособность, стерилизацию проводят «дробно» - три дня подряд. Таким способом стерилизуют среды с углеводами, молоко, среды с желатиной, то есть субстраты, которые не выдерживают нагревания более 100⁰С, длительного действия пара или сухого жара.

5.    Тиндализация – это дробная стерилизация в водяной бане при 56…58⁰С в течение 5…6 суток: в первый день прогревают в течение 2 часов, в последующие дни – по  1 часу. Метод используется для стерилизации материалов, разрушающихся при температуре выше 58…60⁰С – веществ, содержащих белки (сыворотка крови).

6.    Пастеризация – это метод не полной стерилизации, используемы с целью сохранения питательной ценности пищевого продукта, которая может снижаться при кипячении. Продукт нагревают при 80⁰С в течение 30 минут, а затем резко охлаждают до 4…8⁰С. Резкое охлаждение препятствует прорастанию спор и последующему размножению бактерий.

7.    Стерилизация паром под давлением (автоклавирование). Это самый эффективный метод стерилизации. Принцип стерилизации основан на том, что чистый насыщенный водяной пар при высоком давлении, конденсируясь, повышает температуру внутри автоклава выше температуры кипения. При повышении давления пара соответственно повышается и температура в стерилизационной камере: 50,6 кПа (0,5 атм.) – 110…112⁰С, 101,3 кПа (1 атм.) – 120…121⁰С, 151,9 кПа (1,5 атм.) – 124…126⁰С, 202,6 кПа (2 атм.) – 132…133⁰С.  Конструкции и объем стерилизационной камеры автоклавов могут быть различными (горизонтальные и вертикальные), но принцип действия остается таким же. В автоклаве стерилизуют питательные среды, выдерживающие температуру выше 100⁰С, стеклянную посуду, завернутую в бумагу, перевязочный материал, халаты (в биксах). Кроме того, обеззараживают микробные культуры, отработанные питательные среды, посуду. Режимы работы автоклава нуждаются в постоянном контроле. Для этого используют химические и биологические методы.

8.    Стерилизация фильтрованием. Осуществляется пропускание материала через бактериологические фильтры. Фильтрация связана с механической задержкой бактерий мелкопористыми фильтрами и с адсорбционной способностью материала из которого изготовлен фильтр. Фильтрации обычно подвергают жидкости не выдерживающие нагревания. Различают фильтры:

·        керамические – их изготавливают из каолина или кварцевого песка;

·        асбестовые - фильтры Зейтца (пластины из смеси асбеста с целлюлозой);

·        мембранные – имеют вид тонких листков белой бумаги, их  готовят из гемицеллюлозы, обработанной соответствующими реактивами, температурой и прессованием. Эти фильтры различают по диаметру и величине пор, имеют наиболее точную калибровку.

Стерильность фильтратов контролируют высевом на питательные среды с термостатированием.

9.    Стерилизация ультрафиолетовым излучением. В лаборатории источником ультрафиолетового излучения обычно служат бактерицидные лампы, используемые для обеззараживания воздуха.

Стерилизация ультразвуком. С помощью ультразвука стерилизуют воду, молоко, некоторые продукты, кожевенное сырье. Стерилизующее действие ультразвука связано с разрушением бактериальной клетки под действием кавитационных полостей, возникающих в цитоплазме.

Современное оборудование для стерилизации  бывает различных типов и видов.

Для термочувствительных медицинских изделий, таких как эндоскопы, катетеры, микрохирургический инструмент и т.д. применяются установки для стерилизации при помощи низкотемпературных методов. Для стерилизации обычных изделий применяются автоклавы или инфракрасные шкафы.

Автоклав

Автоклав представляет собой установку для стерилизации паром под давлением. Он используется как для обеззараживания нечувствительных к температуре и влажности медицинских инструментов, так и для обработки халатов, перчаток, перевязочного материала.

Сухожаровой шкаф

Стерилизация в сухожаровом шкафу происходит при помощи циркуляции внутри него горячего воздуха. Это оборудование используется для термической стерилизации медицинских инструментов. Преимущество сухожаровых шкафов в том, что инструменты при обработке остаются сухими, благодаря чему не создается риск возникновения коррозии.

В настоящее время все большей популярностью пользуются полностью автоматические стерилизационные приборы. Они оснащаются микропроцессором с несколькими программами стерилизации, которые можно при необходимости перепрограммировать под свои нужды.

Оборудование для стерилизации выпускается двух типов: встроенное в стену и свободной установки.

Габариты стерилизационных установок также бывают различны. В настоящее время существуют стерилизаторы с объемом стерилизационных камер от 10 до 100 литров.  

15. Механизмы действия химических факторов на микробы. Дезинфекция и дезинфицирующие вещества.

Способность ряда химических веществ подавлять жизнедеятельность микроорганизмов и предотвращать порчу органических субстратов известна с глубокой древности. В частности, египтяне широко применяли кислоты, щёлочи, природные ароматические вещества для мумификации умерших; персы-огнепоклонники для предохранения дерева и кожи от гниения использовали нефть и ее продукты. Применение химических веществ — основа метода антисептики (предложил Джозеф Листер в 1867 г.).

Эффективность зависит от концентрации химических веществ и времени контакта с микробом. Химические вещества могут подавлять рост и размножение микроорганизмов, проявляя статический эффект, либо вызывать их гибель [микро-бицидный эффект (от лат. caedo, убивать)]. Дезинфектанты и антисептики дают неспецифический микробицидный эффект; химиотерапевтические средства проявляют избирательное про-тивомикробное действие.

Дезинфектанты. Антисептики.

Дезинфектанты — химические средства неспецифического действии, применяемые для обработки помещений, оборудования и различных предметов. Антисептики — вещества, используемые для обработки живых тканей. Дезинфицирующие средства оказывают в рабочих концентрациях бактерицидное действие, а антисептики (в зависимости от концентрации)— бактериостатическое или бактерицидное.

Антисептики и дезинфектанты обычно легко растворимы в воде и действуют быстро; они дёшевы и при правильном применении не оказывают вредного воздействия на организм человека. Дезинфекцияпозволяет уменьшить число патогенных микроорганизмов на объектах внешней среды. Дезинфекцию проводят с определённой периодичностью (профилактическая дезинфекция), либо при возникновении инфекционного заболевания или подозрении на него (очаговая дезинфекция).

Спирты, или алкоголи (этанол, изопропанол и др.). Как антисептики, наиболее эффективны в виде 60-70% водных растворов. Спирты осаждают белки и вымывают из клеточной стенки липиды. При правильном применении эффективны в отношении вегетативных форм большинства бактерий; споры бактерий и грибов, а также вирусы к ним резистентны. Галогены и галогенсодержащие препараты (препараты йода и хлора) широко применяют как дезинфектанты и антисептики. Препараты взаимодействуют с гидроксильными группами белков, нарушая их структуру.

• Как антисептики применяют йодсодержащие препараты — спиртовой раствор йода (5% в этаноле); йодинол (1% водный раствор содержит 0,1% йода, 0,3% калия йодида и 0,9% поливинилового спирта, замедляющего выделение йода); йодонат (водный раствор комплекса поверхностно-активного вещества с йодом); повидон-йод (комплекс йода с поли-винилпирролидоном) и раствор Люгбля применяют для обработки слизистых оболочек.

• Как дезинфектанты применяют хлорсодержащие препараты — газообразный хлор (взаимодействуя с водой, образует хлорноватистую кислоту; в присутствии органических веществ противомикробное действие уменьшается); хлорную известь (5,25% NaCIO, также образующую при растворении хлорноватистую кислоту); хлорамин Б (содержит 25-29% активного хлора; для обеззараживания питьевой воды применяют в виде таблеток, содержащих 3 мг активного хлора); хлоргексидина биглюконат (гибитан).

Альдегиды алкилируют сульфгидрильные, карбоксильные и аминогруппы белков и других органических соединений, вызывая гибель микроорганизмов. Альдегиды широко применяют как консерванты. Наиболее известные — формальдегид (8%) и глутаральдегид (2-2,5%) — проявляют раздражающее действие (особенно пары), ограничивающее их широкое применение.

• Раствор формальдегида обладает дезинфицирующим и дезодорирующим эффектами. Применяют для мытья рук, дезинфекции инструментов, обработки кожи ног при повышенной потливости. Входит в состав препаратов (формидрон, мазь формалиновая). Мыльный раствор формальдегида (лизоформ) применяют для спринцеваний в гинекологической практике, для дезинфекции рук и помещений.

• Уротропин (гексаметилентетрамин) в кислой среде организма расщепляется с выделением формальдегида; последний, выделяясь с мочой, оказывает антисептическое действие. Применяют при инфекционных процессах мочевыводящих и желчевыводящих путей, кожных заболеваниях. Входит в состав комбинированных препаратов (кальцекс, уробесал).

• Циминаль, цимизоль и цидипол — антисептики, действующие за счёт образования формальдегида путём их гидролиза; применяют для индивидуальной профилактики венерических заболеваний у мужчин после случайных половых связей.

Кислоты и щёлочи применяют как антисептики. Среди кислот наиболее известны борная, бензойная, уксусная и салициловая. Применяют для лечения поражений, вызванных патогенными грибами и бактериями. Наиболее распространена салициловая кислота, применяемая в спиртовых растворах (1-2%), присыпках, мазях, пастах (например, для лечения дерматоми-козов в областях, подверженных трению); оказывает также в зависимости от концентрации отвлекающее, раздражающее и кератолитическое действие. Из щелочей наиболее распространён раствор аммиака (нашатырный спирт содержит 9,5-10,5% аммиака), применяемый для обработки рук хирурга (0,5% раствор).

Металлы. Антимикробный эффект основан на способности осаждать белки и другие органические соединения. В качестве антисептиков широко применяют нитрат серебра (ляпис), сульфат меди (медный купорос) и хромат ртути (мербромин). Соединения металлов (особенно свинца, мышьяка и ртути) не рекомендуют применять для дезинфекции и антисептики, поскольку они способны накапливаться в организме человека. Исключение — сулема (ртути дихлорид), иногда применяемая для дезинфекции белья, одежды, предметов ухода за больными.

Фенолы и их замещённые производные широко применяют как дезинфектанты, в меньших концентрациях — в качестве антисептиков. Препараты денатурируют белки и нарушают структуру клеточной стенки. От применения собственно фенола отказались давно вследствие его токсичности, но его производные (например, гексахлорофен, резорцин, хлорофен, тимол, салол) применяют часто.

Катионные детергенты оказывают бактерицидное действие, связанное с изменением проницаемости ЦПМ. Их эффект уменьшают анионные поверхностно-активные вещества (по этой причине катионные детергенты несовместимы с мылами), низкие значения рН (то есть повышенная кислотность), некоторые органические соединения, ионы металлов. Катионные детергенты адсорбируются пористыми и волокнистыми материалами. При нанесении на кожу образуют плёнку, под которой могут оставаться живые микроорганизмы. Наиболее часто применяют для обработки рук хирурга (препараты циригель, дегмицид, роккал).

Газы как дезинфектанты известны с глубокой древности. Двуокись серы ещё в античности широко применяли для обработки складов и предохранения пищевых продуктов. Не менее широкое распространение получила дератизация двуокисью серы. Для уничтожения спор микроорганизмов при стерилизации предметов из пластмасс применяют окиси этилена и пропилена под давлением при 30-60 "С. Метод позволяет эффективно уничтожать большинство микроорганизмов, в том числе в тканях и жидкостях (кровь, гнойное отделяемое). Механизм действия связан со способностью окиси этилена алкилировать белки. В частности, повреждению подвергаются сульфгидрильные группы вегетативных форм и карбоксильные группы оболочек спор.

Красители. В качестве антисептиков давно применяют различные красители (например, бриллиантовый зелёный, метиленовый синий, риванол, основный фуксин).

Окислители. Механизм антимикробной активности связан с окислением метаболитов и ферментов микроорганизмов, либо денатурацией микробных белков. Наиболее распространённые окислители, применяемые как антисептики, — перекись водорода и перманганат калия (в просторечии, марганцовка).

16. Химиотерапевтические вещества. Химиотерапевтический индекс.

химиотерапевтический индекс

показатель широты терапевтического действия химиотерапевтического средства, представляющий собой отношение его минимальной эффективной дозы к максимальной переносимой.

Химиотерапевтические препараты – это лекарственные вещества, используемые для подавления жизнедеятельности и уничтожения микроорганизмов в тканях и средах больного, обладающие избирательным, этиотропным действием.

По химическому строению выделяют несколько групп химиотерапевтических препаратов:

1) сульфаниламидные препараты (сульфаниламиды). Они нарушают процесс получения микробами ростовых факторов – фолиевой кислоты и других веществ. К этой группе относят стрептоцид, норсульфазол, сульфаметизол, сульфометаксазол и др.;

2) производные нитрофурана. Механизм действия состоит в блокировании нескольких ферментных систем микробной клетки. К ним относят фурацилин, фурагин, фуразолидон, нитрофуразон и др.;

3) хинолоны. Нарушают различные этапы синтеза ДНК микробной клетки. К ним относят налидиксовую кислоту, циноксацин, норфлоксацин, ципрофлоксацин;

4) азолы – производные имидазола. Обладают противогрибковой активностью. Ингибируют биосинтез стероидов, что приводит к повреждению наружной клеточной мембраны грибов и повышению ее проницаемости. К ним относят клотримазол, кетоконазол, флуконазол и др.;

5) диаминопиримидины. Нарушают метаболизм микробной клетки. К ним относят триметоприм, пириметамин;

6) антибиотики – это группа соединений природного происхождения или их синтетических аналогов.

Принципы классификации антибиотиков.

1. По механизму действия:

1) нарушающие синтез микробной стенки (b-лактамные антибиотики; циклосерин; ванкомицин, тейкоплакин);

2) нарушающие функции цитоплазматической мембраны (циклические полипептиды, полиеновые антибиотики);

3) нарушающие синтез белков и нуклеиновых кислот (группа левомицетина, тетрациклина, макролиды, линкозамиды, аминогликозиды, фузидин, анзамицины).

2. По типу действия на микроорганизмы:

1) антибиотики с бактерицидным действием (влияющие на клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану);

2) антибиотики с бактериостатическим действием (влияющие на синтез макромолекул).

3. По спектру действия:

1) с преимущественным действием на грамположительные микроорганизмы (линкозамиды, биосинтетические пенициллины, ванкомицин);

2) с преимущественным действием на грамотрицательные микроорганизмы (монобактамы, циклические полипептиды);

3) широкого спектра действия (аминогликозиды, левомицетин, тетрациклины, цефалоспорины).

4. По химическому строению:

1) b-лактамные антибиотики;

2) аминогликозиды (канамицин, неомицин);

3) тетрациклины (тетрациклин, метациклин);

4) макролиды (эритромицин, азитромицин);

5) линкозамины (линкомицин, клиндамицин);

6) полиены (амфотерицин, нистатин);

7) гликопептиды (ванкомицин, тейкоплакин).

17. Влияние биологических факторов на микроорганизмы. Виды взаимодействия между микроорганизмами. Бактериоциногения

Микроорганизмы подвержены действию не только физических и химических, но и биологических факторов. Биологические факторы, обладающие свойством воздействовать на микроорганизмы, весьма разнообразны. Все живые существа объединены в устойчивые экологические системы – биоценозы. Для каждого биоценоза характерно видовое и количественное соотношение популяций, их структуры и взаимоотношения. Среди большого количества биоценозов особое место занимают микробиоценозы – сообщества (ассоциации) микроорганизмов. Взаимоотношения между отдельными видами микроорганизмов в пределах одного сообщества могут быть различными и проявляться в форме синергизма, сателлизма, антагонизма и др.

Синергизм. Для такого типа взаимоотношений между особями микробной ассоциации характерны одинаковые физиологические процессы у различных микроорганизмов, в результате чего имеет место увеличение количества веществ,  синтезируемых микробной ассоциацией.

Сателлизм. При таком типе взаимоотношений происходит стимуляция роста одного вида микроорганизма продуктами жизнедеятельности другого.

Антагонизм. Для этого типа взаимоотношений характерно угнетение жизнедеятельности (а иногда и полное уничтожение) одних микроорганизмов веществами, синтезируемыми другими микроорганизмами. 

Паразитизм – это такое отношение между членами ассоциации, при котором один из организмов (паразит) получает необходимые вещества за счет другого организма (хозяина), нанося при этом вред, что приводит к гибели хозяина.

Кроме взаимного влияния микроорганизмов друг на друга существуют и другие биологические объекты и, следовательно, и другие виды воздействия. Особый интерес представляет фагия. Это одна из форм взаимодействия между фагами (по своей природе это вирусы) и другими микроорганизмами (бактериями, актиномицетами, синезелеными водорослями). Фаги, как и другие вирусы можно обнаружить при помощи электронного микроскопа. Их размеры достигают 200нм. Фаги имеют овальную головку с отростком (хвостом). Головка окружена белковой оболочкой, внутри ее содержится нуклеиновая кислота (обычно ДНК). Отросток представляет собой полую трубку, покрытую белковым чехлом, способным сокращаться. На конце отростка находится базальная пластинка с зубцами, от которой отходят нити (фибриллы). Процесс взаимодействия фага с клеткой состоит из последовательной смены стадий:

I стадия – адсорбция фага и прикрепление его к клеточной стенке. Фаг «узнает» клетку при помощи концевых нитей своих отростков.

II стадия – проникновение ДНК фага в клетку. Эта стадия происходит под действием ферментов фага, которые разрушают клеточную стенку. Затем происходит сокращение наружной оболочки отростка и содержимое головки (ДНК) выталкивается в клетку.

III стадия – биосинтез фаговой нуклеиновой кислоты и белков капсида. Биосинтеза составных частей фага происходит с использованием веществ микробной клетки.

IV стадия – морфогенез фага. Этот процесс заключается в заполнении фаговой нуклеиновой кислотой пустотелых фаговых капсид и формировании зрелых частиц фага.

V стадия – выход фаговых частиц из разрушенной бактериальной клетки.

Взаимоотношения между фагами и другими микроорганизмами могут проявляться в виде продуктивной инфекции или лизогении. Состояние продуктивной инфекции характерно для фагов-агрессоров (вирулентных). Вирулентные фаги при проникновении в клетку бактерий интенсивно размножаются в ней, вызывая ее гибель. Состояние лизогении характерно для умеренных фагов (фагов-комменсалов). При контакте умеренного фага с бактериальной клеткой, клетка не гибнет, а становится  носителем фага. При этом бактериофаг находится в состоянии профага, его геном ассоциируется с геномом бактерии и воспроизводится как часть бактериальной нуклеиновой кислоты.

По степени специфичности действия фаги подразделяют на три группы:

·        монофаги – способны лизировать бактерии одного вида;

·        полифаги – способны лизировать бактерии разных видов (преимущественно родственных);

·        фаговары – способны лизировать только определенные варианты данного вида бактерий.

Кроме перечисленных широко используется действие еще одной группы биологически активных веществ, способных избирательно подавлять рост, инактивировать микроорганизмы, грибы, риккетсии, простейших и др. Это обширная группа антибиотиков, в настоящее время насчитывающая около 2000 соединений различного происхождения.

По происхождению антибиотики подразделяют на шесть групп:

1.    Антибиотики, образуемые грибами и лишайниками. К этой группе относят пенициллин, гризеофульвин, цефалоспорин, усниновая кислота.

2.    Антибиотики, продуцируемые актиномицетами. К этой группе относят стрептомицин, неомицин, канамицин, хлортетрациклин, хлорамфеникол, эритромицин, тилозин, нистатин.

3.    Антибиотики, продуцируемые бактериями. Эта группа менее обширна, чем группа антибиотиков грибного и актиномицетного происхождения. Способностью продуцировать антибиотики обладают в большинстве своем сапрофитные бактерии, обитающие в почве. К этой группе относят колицин, грамицидин, пиоционин, субтилин, полимиксин. Некоторые из этих антибиотиков токсичны при парэнтеральном введении и применяются местно.

4.    Антибиотики животного происхождения. К этой группе относят вещества, образуемые тканями животных: эритрин, выделяемый из эритроцитов некоторых животных; экмолин, полученный из тканей рыб; лизоцим, интерферон.

5.    Антибиотики растительного происхождения. Многие растения способны синтезировать летучие и нелетучие вещества, обладающие бактерицидным и бактериостатическим действием на микроорганизмы. Такие соединения называют фитонцидами. Фитонциды призваны обеспечить защиту растений от возбудителей различных заболеваний. Некоторые фитонциды выделены в чистом виде. Например, аллицин – из чеснока, рафанин – из семян редиса, иманин – из зверобоя.

6.    Синтетические антибиотики, полученные искусственно путем биосинтеза.

По механизму действия выделяют четыре основные группы антибиотиков:

1.    Антибиотики, ингибирующие синтез пептидогликана клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины).

2.    Антибиотики, нарушающие фенкцию цитоплазматической мембраны (грамицидин, полиены).

3.    Антибиотики, разрушающие рибосомальные субчастицы и сдерживающие синтез белка (тетрациклины, амино-гликозиды, макролиды).

4.    Антибиотики, избирательно подавляющие синтез нуклеиновых кислот (гризеофульвин, неомицин, новобиоцин).

В основе лечения с помощью антибиотиков лежит сложная иммунобиологическая реакция и, применяя антибиотики необходимо помнить об их иммунодепрессивных свойствах. Прежде чем назначить тот или иной антибиотик, необходимо знать его свойства, способ введения, спектр и механизм действия, срок сохранения в организме и пути выведения из организма. При несоблюдении правил применения антибиотиков могут возникнуть тяжелые последствия – токсикозы, морфофункциональные изменения в желудочно-кишечном тракте. Многие антибиотики обладают нейротоксическим, гепатотоксическим, нефротоксическим действием, угнетают функции эндокринной и кроветворной систем. При продолжительном приеме антибиотиков угнетается нормальная микрофлора организма, развиваются дисбактериозы. Одновременно начинает развиваться нечувствительная к антибиотику микрофлора, вызывая развитие суперинфекций (кандидозы). При неправильном применении антибиотиков утрачивается чувствительность возбудителей инфекционных заболеваний  к применяемым препаратам, образуются антибиотико-резистентные формы микроорганизмов. В таких случаях применения антибиотиков с лечебной целью становится бессмысленным.

18. Микробный антагонизм. Антибиотики, единицы действия и способы получения.

В настоящее время различают три способа получения антибиотиков: биологический, метод получения полусинтетических препаратов и синтез химических соединений — аналогов природных антибиотиков.

1. Биологический синтез. Одним из главных условий получения антибиотика в большом количестве является продуктивность штамма, поэтому используются наиболее продуктивные мутанты «диких штаммов», полученные методом химического мутагенеза. Продуцент выращивают в жидкой оптимальной среде, в которую и поступают продукты метаболизма, обладающие антибиотическими свойствами. Антибиотики, находящиеся в жидкости, выделяют, используя ионообменные процессы, экстракцию или растворители. Определение активности антибиотика в основном производится микробиологическими методами с использованием чувствительных тест-микробов. За Международную единицу активности антибиотика (ЕД) принимают специфическую активность, содержащуюся в 1 мкг чистого препарата пенициллина Международная единица активности равна 0,6 мкг.

2. Полусинтетические антибиотики. Их готовят комбинированным способом: методом биологического синтеза получают основное ядро молекулы нативного антибиотика, а методом химического синтеза, путем частичного изменения химической структуры — полусинтетические препараты.

Большим достижением является разработка метода получения полусинтетических пенициллинов. Методом биологического синтеза было извлечено ядро молекулы пенициллина — 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК), которая обладала слабой антимикробной активностью. Путем присоединения к молекуле 6-АПК бензильной группы создан бензилпенициллин, который теперь получают и методом биологического синтеза. Широко применяемый в медицине под названием пенициллин, бензилпенициллин обладает сильной химиотерапевтической активностью, но активен лишь в отношении грамположительных микробов и не действует на, устойчивые микроорганизмы, особенно стафилококки, образующие фермент — р-лактамазу. Бензилпенициллин быстро теряет свою активность в кислой и щелочной средах, поэтому его нельзя применять перорально (он разрушается в желудочно-кишечном тракте).

Другие полусинтетические пенициллины: метициллин (Meticillin) — применяется для лечения инфекций, вызванных устойчивыми к бензилпенициллину стафилококками, так как не разрушается под действием фермента — (3-лактамазы; оксациллин (Oxacillin) — устойчив к кислой среде, поэтому его можно применять внутрь; ампициллин — задерживает размножение не только грамположительных, но и грамотрицательных бактерий (возбудителей брюшного тифа, дизентерии и др.).

Полусинтетические препараты получают также на основе 7-аминоцефалоспориновой кислоты (7-АЦК). Производные 7-АЦК: цефалотин (Cefalotin), цефалоридин (Сеfaloridinum) не дают аллергических реакций у лиц, чувствительных к пенициллину. Получены и другие полусинтетические антибиотики, например рифампицин (Rifampicinum) — эффективный противотуберкулезный препарат.

3. Синтетические антибиотики. Изучение химической структуры антибиотиков дало возможность получать их методом химического синтеза. Одним из первых антибиотиков, полученных таким методом, был левомицетин. Большие успехи в развитии, химии привели к созданию антибиотиков с направленно измененными свойствами, обладающих пролонгированным действием, активных в отношении устойчивых к пенициллину стафилококков. К пролонгированным препаратам относятся экмоновоциллин(Ecmonovocillinum), бициллин 1,3,5.

По спектру действия все антибиотики принято классифицировать на антибактериальные, антигрибковые и противоопухолевые.

Антибактериальные антибиотики угнетают развитие бактерий. Существуют антибиотики узкого спектра действия, которые угнетают рост только грамположительных или грамотрицательных бактерий (например, полимиксин (Polymyxin) и др.), и антибиотики широкого спектра, которые угнетают рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. К антибиотикам широкого спектра относятся беталактамиды, составляющие группу, в которую входят пенициллины и цефалоспорины. Основу молекул этих антибиотиков составляет бета-лактамное кольцо. Они обладают следующими свойствами: бактерицидный тип действия, высокая токсичность в отношении грамположительных микробов, быстрое наступление антибактериального эффекта и хорошая переносимость макроорганизмом, даже при длительном применении. В эту группу входят биосинтетические пенициллины, полусинтетические пенициллины, действующие на грамположительные микробы, и полусинтетические пенициллины и цефалоспорины с широким спектром действия.

Тетрациклины — группа антибиотиков широкого спектра действия, в которую входят природные антибиотики (тетрациклин, окситетрациклин и др.) и их полусинтетические производные.

Единица действия (ЕД) соответствует действию определенной единицы массы химически чистого кристаллического вещества. Для многих антибиотиков 1 ЕД соответствует 1 мг химически чистого вещества в виде основания, кислоты или соответствующей соли (тетрациклин, эритромицин и др.). Для тех антибиотиков, которые были получены в чистом виде после расчета для них ЕД, принятая в настоящее время 1 ЕД не соответствует 1 мг чистого вещества.

19. Классификации антибиотиков по биологическому происхождению, по спектру биологического действия, по химическому строению.

По происхождению антибиотики подразделяют на шесть групп:

1.    Антибиотики, образуемые грибами и лишайниками. К этой группе относят пенициллин, гризеофульвин, цефалоспорин, усниновая кислота.

2.    Антибиотики, продуцируемые актиномицетами. К этой группе относят стрептомицин, неомицин, канамицин, хлортетрациклин, хлорамфеникол, эритромицин, тилозин, нистатин.

3.    Антибиотики, продуцируемые бактериями. Эта группа менее обширна, чем группа антибиотиков грибного и актиномицетного происхождения. Способностью продуцировать антибиотики обладают в большинстве своем сапрофитные бактерии, обитающие в почве. К этой группе относят колицин, грамицидин, пиоционин, субтилин, полимиксин. Некоторые из этих антибиотиков токсичны при парэнтеральном введении и применяются местно.

4.    Антибиотики животного происхождения. К этой группе относят вещества, образуемые тканями животных: эритрин, выделяемый из эритроцитов некоторых животных; экмолин, полученный из тканей рыб; лизоцим, интерферон.

5.    Антибиотики растительного происхождения. Многие растения способны синтезировать летучие и нелетучие вещества, обладающие бактерицидным и бактериостатическим действием на микроорганизмы. Такие соединения называют фитонцидами. Фитонциды призваны обеспечить защиту растений от возбудителей различных заболеваний. Некоторые фитонциды выделены в чистом виде. Например, аллицин – из чеснока, рафанин – из семян редиса, иманин – из зверобоя.

6.    Синтетические антибиотики, полученные искусственно путем биосинтеза.

По механизму действия выделяют четыре основные группы антибиотиков:

1.    Антибиотики, ингибирующие синтез пептидогликана клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины).

2.    Антибиотики, нарушающие фенкцию цитоплазматической мембраны (грамицидин, полиены).

3.    Антибиотики, разрушающие рибосомальные субчастицы и сдерживающие синтез белка (тетрациклины, амино-гликозиды, макролиды).

4.    Антибиотики, избирательно подавляющие синтез нуклеиновых кислот (гризеофульвин, неомицин, новобиоцин).

По химическому строению выделяют следующие группы антибиотиков:

1. β-лактамные антибиотики (пенициллины, цефалоспорины, карбопенемы, монобактамы).

2. Макролиды и близкие к ним антибиотики.

3. Аминогликозиды.

4. Тетрациклины.

5. Полимиксины.

6. Полиены (противогрибковые антибиотики).

7. Препараты хлорамфениколя (левомицетина).

8. Гликопептидные антибиотики.

9. Антибиотики разных химических групп.

20. Механизмы действия различных групп антибиотиков.

Механизм и характер антимикробного действия антибиотиков.

Механизм действия	Антибиотики	Преимущественный характер антимикробного действия
Нарушение синтеза клеточной стенки	β-локтамиды Гликопептидные антибиотики Циклосерин Бацитрацин	Бактерицидный - - -
Нарушение проницаемости цитоплазмы мембран	Полимиксины Полиеновые антибиотики	Бактерицидный -
Нарушение внутриклеточного синтеза белка	Макролиды Тетрациклины Линкозамиды Левомицетин Аминогликозиды	Бактериостатический - - - Бактерицидный
Нарушение синтеза РНК	Рифампицин	Бактерицидный

Из таблицы видно, что бактерицидный эффект оказывают преимущественно те антибиотики, которые нарушают синтез клеточной стенки, изменяют проницаемость цитоплазмы мембран или нарушают синтез РНК в микроорганизмах. Бактериостатическое действие характерно для антибиотиков, нарушающих внутриклеточный синтез белка.

21. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам методами разведений и дисков.

Метод серийных разведений.

Методом серийных разведений МИК определяют по минимальной концентрации антибиотика, задерживающей видимый рост микроба в пробирках или чашках с питательной средой, содержащих убывающие концентрации антибиотика. Например, для определения МИК тетрациклина в отношении культуры Staphylococcus aureus, выделенной от больного, в ряду пробирок готовят двукратно убывающие концентрации этого антибиотика в стандартном питательном бульоне, для чего содержимое пробирки перемешивается и переносится 1 мл из 2-й пробирки в 3-ю, из 3-й – в 4-ю и т. д., а из последней пробирки 1 мл удаляется (таблица).

Определение чувствительности микроорганизмов к

антибиотикам (МИК, мкг/мл) методом серийных разведений в бульоне.

Ингредиенты	Номер опытной пробирки (конечная концентрация антибиотика мкг/мл)					Контроль
	1 2 3 4 5 (64) (32) (16) (8) (4)					Культуры	Буль оны	Антибиотики
1. Бульон, мл	-	1	1	1	1	1	1	-
2. Раствор антибиотика (64 мкг/мл), мл	1	1	-	-	-	-	-	1
3. Испытуемая культура/стандартизованная суспензия	2	2	2	2	2	2	-	-

Инкубирование в оптимальных для культуры условиях 18-24 ч.

Пример учета	-	-	-	+	+	+	-	-
Интерпретация результата: МИК тетрациклина в отношении испытуемой культуры – 16 мкг/мл.

Учетным признаком при этом является наличие или отсутствие мутантности бульона в пробирках. В контроле культуры должна быть мутантность, в остальных контролях – нет. Величина МИК соответствует той минимальной концентрации, при которой отсутствует мутность (бульон в пробирках прозрачен). Так, если бульон будет мутным в 4-й или 5-й опытных пробирках, МИК тетрациклина = 16 мкг/мл. Известно, что величина К тетрациклина при введении среднетерапевтических доз – 2 мкг/мл (при использовании максимальных доз – 10 мкг/мл). Следовательно, в данном случае терапевтический индекс будет равен Т = ¹⁶/₂ = 8 (> 0,3), т. е. возбудитель устойчив к антибиотику и лечение тетрациклином не дает антимикробного эффекта в отношении Staphylococcus aureus у данного больного даже при введении максимальных доз (Т = ¹⁶/₁₀ = 1,6).

Метод серийных разведений считается наиболее точным, но относительно трудоемким.

Диско-диффузный метод.

При определении чувствительности методом диффузии в агар чистую культуру возбудителя засевают «газоном» на питательной агар в чашке, например, тампоном, смоченным в стандартизованной (10⁸ КОЕ/мл) суспензии микроорганизма. Затем на поверхность агара укладывают стандартные бумажные диски, пропитанные антибиотиками, которые диффундируют в агар, создавая градиент концентрации. На чашку диаметром 90 мм равномерно укладывают не более шести дисков с определенным количеством антибиотика. После инкубирования в термостате измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков и по специальным таблицам определяют степень чувствительности к тому или иному антибиотику. Каждому значению диаметра зоны вокруг диска с антибиотиком соответствует определенное значение МИК. Исходя из этих значений, для каждого антибиотика рассчитаны величины терапевтического индекса, что позволяет по диаметру зоны определить степень чувствительности к тому или иному антибиотику: чувствительные (S), умеренно-устойчивые (I) и устойчивые (R). К категории S (от английского sensitive – чувствительный) относят те, для которых использование средних терапевтических доз будет достаточным для трехкратного превышения МИК. В категорию I (от английского intermediate - промежуточный) относят те микробы, для подавления которых потребуются максимальные терапевтические дозы. Категорию R (от английского resistant - устойчивый) составляют те микроорганизмы, в отношении которых данный антибиотик будет неэффективным in vivo.

22. Механизмы возникновения антибиотикорезистентности бактерий и пути их преодоления. Принципы рационального применения антибиотиков.

Механизмы резистентности к антибиотикам у бактерий. Их можно классифицировать следующим образом: 1) модификация антибиотиков (другое название процесса — детоксикация). Заключается в разрушении антибиотика еще до его проникновения в цитоплазму клетку (внешняя среда, периплазматическое пространство грамотрицательных бактерий). При этом мишени антибиотиков в цитоплазме клетки остаются интактными. Осуществляется бактерией с помощью специфических ферментов, расщепляющих антибиотик до структур, не представляющих для нее опасности; 2) уменьшение проницаемости стенки бактерии для антибиотиков и/или выкачивание его из клетки («efflux pump») быстрее, чем антибиотик поразит свои мишени. Аналогичным образом действует судовая помпа, выкачивающая из трюма корабля забортную воду; 3) структурные изменения в молекулах, являющихся мишенями для антибиотиков. Проникший в клетку антибиотик не находит свои мишени и не может блокировать биохимические процессы; 4) продукция бактерией альтернативных мишеней, которые резистентны к ингибирующему действию антибиотика. Они связывают антибиотик и лишают его возможности поразить настоящие мишени. Обычно в качестве ложных целей выступают ферменты.

Устойчивость к антибиотикам, обусловленная плазмидами, преимущественно обеспечивается ферментами, модифицирующими антибиотики. Устойчивость к сульфаниламидам и триметоприму [3] вызвана тем, что плазмиды детерминируют дублирующие ферменты биосинтеза витаминов, нечувствительные к этим лекарственным препаратам. Но и для других механизмов резистентности показана возможность ее передачи посредством мобильных генетических элементов. Даже структурные изменения мишеней для антибиотиков могут быть вызваны вставочной активностью транспозонов.

Фундаментальной причиной, способствующей закреплению в ходе эволюции за грамположительными бактериями устойчивости данного типа к антибиотикам, является отсутствие в их клеточной стенке периплазматического пространства. Уровень антибиотикорезистентности грамположительных микроорганизмов зависит от специфичности фермента и того его количества, которое он может позволить себе экспрессировать. Бета-лактамазы таких бактерий, как правило, имеют высокий аффинитет к бета-лактамным антибиотикам [8].

У грамотрицательных микроорганизмов деструкция бета-лактамных антибиотиков осуществляется в периплазматическом пространстве. Поэтому их уровень резистентности зависит от скорости, с которой бета-лактамазы проникают в периплазматическое пространство и скорости осуществляемого ферментами гидролиза. Такие бактерии обычно синтезируют меньшее количество фермента. Кроме того, он имеет меньшую субстратную специфичность (аффинитет), чем у грамположительных бактерий [8].

Большинство патогенных видов бактерий, встречающихся в стационарах, чувствительно, по меньшей мере, к одному классу бета-лактамовых антибиотиков [10].

Менее распространенной причиной резистентности бактерий к пенициллинам и цефалоспоринам могут быть мутации в генах пенициллинсвязывающих белков. Они приводят к пониженной аффинности этих белков к бета-лактамовым антибиотикам. Реже резистентность к таким антибиотикам вызывается их пониженным поглощением клеткой из-за изменений в ее оболочке или активного «откачивания» из бактериальной клетки проникшего антибиотика [10].

23. Классификация, морфология, химический состав и ультраструктура вирусов.

Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в ци­топлазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке от­дельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом.

Форма вирионов может быть раз­личной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиели­та, ВИЧ), в виде сперматозоида (многие бактериофаги). Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы.Простые, или безоболочечные, вирусысостоят из нуклеиновой кисло­ты и белковой оболочки, называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц — капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид.Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены ли-попротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболоч­ка является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые ши­пы, или шипики (пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов нахо­дится матриксный М-белок.

Капсид и суперкапсид защищают вирионы от влияния окру­жающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с клетками, определяют антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называ­ются сердцевиной.

спираль­ный, икосаэдрический (кубический) или слож­ный тип симметрии. Икосаэдрический тип сим­метрии обусловлен образованием изометричес­ки полого тела из капсида, содержащего вирус­ную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спираль­ный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).Включения — скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выяв­ляемые под микроскопом при специальном окрашива­нии. Вирус натуральной оспы образует цитоплазмати-ческие включения — тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы — внутриядерные включения.

Размеры вирусов определяют с помощью электронной мик­роскопии, методом ультрафильтрации через фильтры с извест­ным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования. Одним из самых мелких вирусов является вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным — натуральной оспы (около 350 нм)Вирусы имеют уникальный геном, так как содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны, т.е. име­ют один набор генов. Геном вирусов представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитчатыми, однонитчатыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными. Геном вирусов способен включаться в состав генетического аппарата клетки в виде провируса, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов (вирусы герпеса и др.) могут находиться в цитоплазме инфициро­ванных клеток, напоминая плазмиды.Тип симметрии. Капсид или нуклеокапсид могут иметь спираль­ный, икосаэдрический (кубический) или слож­ный тип симметрии. Икосаэдрический тип сим­метрии обусловлен образованием изометричес­ки полого тела из капсида, содержащего вирус­ную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спираль­ный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).

В основу классификации вирусов положены следующие кате­гории:

•  тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структура, ко­личество нитей (одна или две), особенности воспроизводства вирусного генома;

•  размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии;

•  наличие суперкапсида;

•  чувствительность к эфиру и дезоксихолату;

•  место размножения в клетке;

•  антигенные свойства и пр.

24. Типы вирусных нуклеиновых кислот и их репликация.

• ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота). Сахар — дезоксирибоза, азотистые основания: пуриновые — гуанин (G), аденин (A), пиримидиновые — тимин (T) и цитозин (C). ДНК часто состоит из двух полинуклеотидных цепей, направленных антипараллельно.

• РНК (рибонуклеиновая кислота). Сахар — рибоза, азотистые основания: пуриновые — гуанин (G), аденин (A), пиримидиновые урацил (U) и цитозин (C). Структура полинуклеотидной цепочки аналогична таковой в ДНК. Из-за особенностей рибозы молекулы РНК часто имеют различные вторичные и третичные структуры, образуя комплементарные участки между разными цепями.