Выделение белка Est3
Первым этапом работы было выделение белка Est3. Для этого клетки E.coli были трансформированы экспрессионными плазмидами, содержащими ген полноразмерной формы белка Est3, и содержащего дополнительную последовательность из 6 гистидинов на C-конце для возможности выделения данных белков методами афинной хроматографии. Также, в обоих плазмидах присутствовал ген His3MX6, с помощью которого клетка может выжить в среде без гистидина.
Клетки растили в среде LB до OD600=0,4-0,6, индуцировали 24 мкл IPTG и растили 14 часов при 16°C. Выделение белков проводилось методами афинной хромотографии на Ni-сефарозе. В результате был выделен белок Est3.
Выделение и формирование РНК и ДНК G-квадруплексов
Для достижения данной задачи использовали ДНК и РНК олигонуклеотиды, образованные четырьмя теломерными повторами а также нетоломерный ДНК олигонуклеотид. Формировнаие G-квадруплексов проводили двумя различными методами. По первой методике олигонуклеотиды упаривали в 200мМ ацетате аммония, при этом предположительно образовывались межмолекулярные квадруплексы. По второй методике олигонуклеотиды упаривали в 200мМ хлориде калия, при этом предположительно образовывались мономолекулярные квадруплексы.
Общие положения по выполнению эксперимента для определения констант взаимодействия белка Est3 дикого и мутантного типа с G-квадруплексами
Константы вазимодействия Est3 с квадруплексами определялись титрованием меченых на 5’-конце флуоресцеином квадруплексов белком Est3. Измерение проводилось с помощью автоматизированной рабочей станции Janus фирмы Perkin Elmer. В 8 ячеек в одном столбце 96-луочной планшеты для измерения флуоресценции добавлялось по 40 мкл квадруплекса или одноцепочечной ДНК с концентрацией 1 μМ в буфере Б-100 без глицерина. Затем к образцам добавлялось одинаковое количество белка в буфере Б-100 образцы инкубировались при 30˚С при перемешивании в течение 45 секунд. После этого планшет переносился в интегрированный прибор для измерения анизотропии флуоресценции Victor3000 фирмы Perkin Elmer. В данной работе также используются следующие обозначения: NH4+ - квадруплексы, полученные упариванием в 200мМ ацетате аммония, K+ - квадруплексы, полученные упариванием в 200мМ хлориде калия, буквы Д или Р соответственно для обозначения ДНК и РНК олигонуклеотидов, цифра после заглавной буквы Д или Р обозначает количество теломерных повторов (в нашем случае - 4)
Доказательство специфичности взаимодействия белка Est3 дикого типа с g-квадруплексами
Для доказательства специфичности взаимодействия Est3 с G-квадруплексами проводили измерения анизотропии флуоресценции в различных случаях. В первой серии опытов белок Est3 взаимодействовал с Д4 NH4+ квадруплексом (1). Во второй серии опытов проводили взаимодействие с одноцепочечным олигонуклеотидом Д4 (2). В третьей серии опытов проводили взаимодействие с нетеломерным олигонуклеотидом (3). Ниже представлен график, полученный при обработке выходных данных. Как видно, взаимодействие наблюдается только для G-квадруплекса, при этом константа диссоциации комплекса равна 1,4 мкМ. Взаимодействия в двух других случаях не наблюдалось. Тем самым доказали специфичность взаимодействия с квадруплексами.
1
2
3
Сравнение взаимодействия белка Est3 с различными типами G-квадруплексов
Провели измерения для теломерных Д4 олигонуклеотидов, полученных упариванием в ацетате аммония (предположительно межмолекулярный квадруплекс) и упариванием в хлориде калия (предположительно мономолекулярный квадруплекс). Оказалось, что взаимодействие лучше для межмолекулярного квадруплекса. Квадруплекс, полученный упариванием в хлориде калия более стабилен, чем в случае упаривания в ацетате аммония, и возможно, что в процессе взаимодействия меняется конформация квадруплексов.
Д4 NH4+
Д4 K+
Сравнение дикого и мутантного типа белка Est3
Для выяснения, приводит ли отсутствие взаимодействия Est3 с ДНК G-квадруплексами к нарушению работы теломеразы, был выбран мутантный аналог Est3D164A, экспресированный по гену Est3 приводящим к изменению последовательности белка с заменой 164 аспарагиновой кислоты на аланин. Оказалось, что белок дикого типа взаимодействует лучше, чем белок мутантного типа. Увеличение константы диссоциации в 3 раза для мутантной форсы может быть одной из причин нарушения работы теломеразы. Недавно было показано, что Est1 способен сворачивать ДНК-квадруплесы. Таким образом, логичным является предположение, что Est3 связывается и стабилизирует G-квадруплексы, образованные Est1 для нормальной работы теломеразы.
