Участие terra в работе теломеразы

Н

3

е смотря на то, что теломеры являются гетерохромосомной структурой, недавние исследования показали, что эукариотическая теломера все же подвергается процессу транскрипции при помощи ДНК-зависимой полимеразы PolII. Итогом этого процесса выступает молекула TERRA (TElomeric Repeat-containing RNA), содержащая теломерные повторы. TERRA транскрибируется с нескольких, может быть всех, хромосомных концов комплементарной цепи, начиная с субтеломерной области в направлении концов хромосом. Ядерная локализация TERRA и ее ассоциированность с теломерами указывает на то, что TERRA не транслируется, но при этом выполняет какую-то роль в теломерных гетерохроматиновых структурах. Достоверно известно, что TERRA в определенных обстоятельствах мешает процессу полуконсервативной репликации теломерной ДНК. Однако, транскрипция TERRA с теломерной ДНК может глобально регулировать работу фермента теломераза, а, следовательно, длину индивидуальных теломер на хромосомах, поскольку TERRA оказывает ингибирующее воздействие на теломеразу. Возможно, это обстоятельство как-то связано с тем, что в клетке в среднем удлиняются теломеры, которые короче чем ближайшие соседи в пределах одной клетки.Как известно, теломеры сами по себе образуют различные структуры (t-петли, G-квадруплексы), которые активно мешают процессу репликации. Известно также, что в субтеломерных областях существуют области, богатые С (CpG strands). С этими областями TERRA может связываться и закрепляться на хромосоме. Далее TERRA, предположительно, образует межмолекулярные G-квадруплексы с теломерной ДНК, что отрицательно сказывается на процессе репликации. Действительно TERRA накапливается в ранней G1-фазе и ее концентрация падает к S-фазе, а самый минимум концентрации TERRA приходится на период от S-фазы до G2-фазы [10]. Известно также, что хеликаза UPF1 также регулирует распространенность TERRA [11] (в местном масштабе хеликаза UPF1 может разлагать TERRA для нормальной работы репликационной вилки). Таким образом избегается нежелательный отжиг TERRA к одноцепочечной теломернной ДНК.

Вся человеческая и в большинстве своем дрожжевая TERRA на 5’ конце кэпирована 7-мелилгуанозином. Это показывает, что 5’ концы TERRA определяются местом начала транскрипции и посттранскрипционной модификации не происходит (например, отрезания 5’ конца РНК). 3’ конец TERRA редко бывает полиаденилированным, но все же хвосты polyA влияют на стабильность TERRA. Так, например, PolyA-TERRA имеет период полураспада около 3 часов, тогда как PolyA+TERRA – более 8 часов.

Результаты и обсуждение

Постановка задачи

Белок Est2 вместе с теломеразной РНК образует так называемый коровый фермент, достаточный для работы теломеразы in vitro, однако in vivo для работы теломеразного комплекса исследуемых дрожжекй необходимы такие белки как Est1 и Est3. Функции белка Est3 до сих пор остаются не совсем понятными.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что белок Est3 взаимодействует с ДНК G-квадруплексами. Было высказано предположение, что данная функция белка необходима для работы теломеразного комплекса.

Подтверждение сенессенс фенотипа штамма дрожжей с мутантной формой белка Est3D164A

Мутантная форма Est3D164A представляет собой белок Est3, у которого сохранено взаимодействие с остальными компонентами теломеразного комплекса, при том, что работа самого комплекса нарушается. Сам по себе белок Est3D164A получен заменой 164 аспарагиновой кислоты на аланин. Штамм с заменой гена на хромосоме был получен ранее в нашей лаборатории.

Была получена серия чашек Петри с колониями дрожжей, посаженными в капле среды, концентрация которой менялась последовательными разведениями. Предварительно, клетки растили в течении от 10 до 100 поколений после замены гена Est3 на хромосоме. Ниже показана чашка Петри (рисунок слева) с клетками, которые предварительно растили в жидкой среде в течении 30 поколений (менее 50 поколений, то есть до наступления сенессенса). Колонии клеток в последовательных разведениях выглядят одинаково для всех штаммов. Рядом (рисунок справа) показана чашка Петри с клетками, которые предварительно растили в жидкой среде в течении 70 поколений с того же момента (более 50 поколений, то есть после наступления сенессенса).

Рис. 4 Фенотип полученных штаммов, экспрессирующих мутантный Est3. Серия разбавлений равного количества клеток разных штаммов была высеяна на чашки Петри со средой YPD. Рисунок слева - до наступления сенессенса. рисунок справа - после наступления сенессаенса

Таким образом дрожжи, в которых ген белка дикого типа заменен на ген, несущий мутации и приводящий к экспрессии белка Est3, проявляют сенессенс фенотип, что подтверждает важность этой аминокислоты для нормальной работы теломеразного комплекса in vivo.