Субтеломерные области дрожжевых хромосом
При движении вглубь хромосом сразу после G-богатой области теломерных повторов следует так называемая субтеломерная область. Она также состоит из различных повторяющихся нуклеотиднных последовательностей, длина ее составляет в среднем около 2500 пар оснований. Исторически повторяющиеся нуклеотидные последовательности субтеломерных областей дрожжевых хромосом были разделены на две основные группы, которые получили название X и Y’ элементы [6, 7]. Однако, в процессе дальнейшего изучения дрожжевых хромосом, эта классификация приобрела более детальный характер. Было выяснено, например, что X элементы могут различаться между собой. В Saccharomyces cerevisiae на конце каждой хромосомы всегда обязательно присутствует так называемый коровый X элемент, рядом с которым могут располагаться протяженные последовательности небольших гетерогенных субтеломерных повторов, которые называются A, B, C, D элементы. Биологическая роль субтеломерных повторов пока не до конца выяснена. На сегодняшний день можно говорить о том, что субтеломерные области влияют на различные процессы, происходящие в клетках. Один из них - альтернативный теломеразному синтезу процесс поддержания длины теломер при помощи гомологической рекомбинации. Также, в суббтеломерных областях существуют так называемые CpG-островки (богатые C нуклеотидами), которые участвуют в первичном связывании теломерной РНК (TERRA) с теломерой.
Теломеразный комплекс дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Белковые субъединицы дрожжевого теломеразного комплекса были найдены при поиске генов, удаление которых приводило бы к фенотипу с отсутствием теломеразной активности. Этот фенотип еще называют Est (Ever Shorter Telomeres), и он характеризуется тем, что при каждом клеточном делении происходит укорочение длины теломер, что в итоге приводит к сенессенсу. В результате поиска мутантов с такими фенотипами были открыты компоненты теломеразного комплекса, белки Est1, Est2, Est3 (а также теломеразная РНК). Ген, кодирующий теломеразную РНК Saccharomyces cerevisiae назвали TLC1. Исследователей также волновал вопрос, обладают ли данные белки какими-либо другими функциями в клетке, кроме того, что они учатствуют в процессе удлинения теломер.
В составе теломеразы дрожжей Est2 является обратно-транскриптазной субъеденицей и вместе с теломеразной РНК образует так называемый коровый фермент, который достаточен для проявления теломеразной активности in vitro.
Теломеразные РНК различных организмов довольно сильно различаются друг от друга по размерам и вторичной структуре. В основном, длина теломеразной РНК возрастает от низших эукариот к высшим. Теломеразная РНК Saccharomyces cerevisiae имеет длину примерно 1300 нуклеотидных остатков. Как оказалось при дальнейших исследованиях, для функционирования теломеразы Saccharomyces cerevisiae важно меньше половины нуклеотидов (около 500). Появилась теория о том, что теломеразная РНК служит «гибкой платформой, основанием для связывания ключевых белков».
Белки Est1 и Est3 обладают регуляторными функциями и необходимы для работы теломеразы in vivo. Как оказалось, Est1 в Saccharomyces cerevisiae может защищать концы хромосом от деградации (возможно, что и Est2 также участвует в этом процессе). Также, недавние исследования показали, что белок Est1 способен формировать G-квадруплексы, возможно, необходимые для посадки теломеразы на теломеру. Первичной регуляторной ролью Est1 является доставка теломеразы к концевым участкам хромосом и продвижение белка Est2 (обратной транскриптазы) по теломере.
Белок Est3 взаимодействует с одноцепочечным теломерным олигонуклеотидом в последовательности G-богатой цепи теломерной ДНК в присутствии ATP и GTP (ADP и GDP снижали взаимодействие) []. С РНК олигонуклеотидами связывание в этом случае было сильнее. На этом основании можно утверждать, что Est3 сильнее взаимодействует с РНК. Стоит отметить, что РНК олигомер с последовательностью G-богатой цепи теломеразной РНК (TERRA) имеет несколько конформаций, детектируемых в полиакриамидном геле которые исчезали при добавлении избытка белка. Это может свидетельствовать о том, что белок Est3 специфично связывается только с определенной конформацией РНК.
Также имеются сведения о том, что Est3 способен специфично разворачивать ДНК/РНК гетеродуплексы в присутствии ATP и GTP (ADP и GDP снижали взаимодействие) [] . Опять же, с позиции недавних открытий, можно предположить, что Est3 участвует в работе TERRA.
G-квадруплексы
G-квадруплексы впервые были обнаружены в 1962 году и практически не изучались, пока в работе, посвященной теломеразе и выпущенной в 1990 году, не была показана важность G-квадруплексов в работе теломеразы. В связи с этим сегодня интерес к гуаниновым не уотсон-криковским структурам сильно возрос. Активно изучается роль G-квадруплексов в жизни клетки.
G-квадруплексы представляют собой стопку координированных G-квартетов. Каждый G-квартет состоит из четырех 5’-GMP (что обуславливает хиральность комплекса в целом), связанных между собой водородными связями. G-квадруплекс электростатически нестабилен, поэтому часто в промежутках между G-квартетами находятся положительно заряженные ионы щелочных металлов. Показано [ссылочка], что наибольшая стабильность достигается в случае иона K+ (для него даже приводятся термодинамические данные значений ΔH и ΔS).Одноцепочечная ДНК по-
Рис. 2 Различные
виды G-квадруплексов
разному может располагаться в полученном квадруплексе. Как видно на рисунке, одноцепочечная ДНК может располагаться параллельно друг другу (a); иметь вид двух параллельных друг другу «петель» (б); двух диагональных и противонаправленных петель по диагоналям (в); унимолекулярный G-квадруплекс, где одноцепочечная ДНК располагается в виде диагональной петли (г).
Имеются данные о том, что довольно большое количество G-квадруплексов содержится в раковых клетках. Также известно, что в раковых клетках активна теломераза. В связи с этим можно выдвинуть предположение, что G-квадруплекс имеет прямое отношение к работе фермента теломераза и что разрушение G-квадруплекса, возможно, будет способствовать ингибированию теломеразы. Возможно, что агент, стабилизирующий G-квадруплексы, будет использоваться в лекарствах против рака, направленных на ингибирование теломеразы.
G-квадруплексы в теломере
На сегодняшний день нет четких доказательств того, что теломерные повторы дрожжей образуют G-квадруплексы in vivo, однако есть многочисленные косвенные факты, указывающие на то, что все-таки данные структуры образуются.
Например, на сегодняшний день известно множество белков, способных связываться с G-квадруплексами, формировать или разрушать данные структуры []. Также, известны нуклеазы, специфично разрезающие ДНК внутри или около квадруплексов. А так как наибольшая концентрация остатков гуанозина наблюдается только в таких объектах как теломеры, промоторы некоторых генов и участки, подверженные частой рекомбинации, то можно предположить формирование G-квадруплексов для теломерных участков. Образование квадруплексов в теломерных областях ДНК было показано in vivo для человека и простейших.
Многие низкомолекулярные ароматические соединения стабилизируют G-квадруплексы как in vivo (для человека), так и in vitro. Притом, in vivo это приводит к ингибированию удлинения теломер в раковых клетках. На этом основано действие разрабатываемых по сегодняшний день противораковых препаратов.
Опубликована статья [15], в которой показано формирование G-квадруплексов в генетическом материале инфузорий in vivo. Авторами работы были получены антитела, способные связываться с антипараллейльными ДНК G-квадруплексами. При этом такие антитела взаимодействовали с макронуклеусом Stylonychia lemnae.
Было подтверждено также и образование G-квадруплексов in vivo у человека [16-18], для чего использовался особый краситель, который дает разные спектры испускания при связывнии с различным субстратом – ДНК-дуплексом или ДНК G-квадруплексом (545 и 575 нм соответственно). Сравнение спектров флуоресценции показало, что квадруплексы действительно существуют на концах хромосом.