Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова

Химический факультет

Кафедра химии природных соединений

Лаборатория химии нуклеопротеидов

Тема: Изучение взаимодействия белка Est3, компонента теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces сerevisiae с G-квадруплексами.

Курсовая работа по биохимии студента 110 группы Дихтяр Ю.Ю.

Научный руководитель: к.х.н. Логвина Н.А.

Москва 2012

Оглавление

Введение

На концах хромосом присутствуют специальные ДНК-белковые структуры – теломеры, защищающие концы хромосом от деградации и слияния. Так как аппарат репликации клетки не способен обеспечивать полную репликацию концевых участков хромосом, существует специальный фермент – теломераза, достраивающие теломерные повторы ДНК [1]. Тонко регулируется количество теломеразы в клетках различного типа [2, 3]. В связи с этим (в человеческих клетках), угнетение активности теломеразы, укорочение длины теломер и как следствие – сенессенс, ведут к ограничению потенциала деления клетки и предотвращению перерождения. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, как хорошо изученный и удобный для культивирования и генетических манипуляций эукариотический микроорганизм, являются хорошей модельной системой для изучения теломеразы.

Теломеразный комплекс дрожжей Saccharomyces cerevisiae состоит из трех белков Est, найденных при поиске генов, делеция которых приводила бы к сенессенс фенотипу с отсутствием теломеразной активности.

Не смотря на интенсивное изучение теломеразы, до сих пор не полностью ясна роль белка Est3 в работе комплекса. Существует предположение, что данный белок способен образовывать комплексы с G-квадруплексами, структурами, образующимися под действием белка Est1. В данной работе определяется константа связывания Est3 и квадруплексов, что поможет в более детальном понимании этапов работы теломеразы.

Список сокращений

ДНК	дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК	рибонуклеиновая кислота
ЭДТА	этилендиаминтетраацетат натрия
GTP	гуанозин-5′-трифосфат
GDP	гуанозин-5′-дифосфат
ATP	аденозин-5′-трифосфат
ADP	аденозин-5′-дифосфат
E. coli	Escherichia coli
S. cerevisiae	Saccharomyces cerevisiae
Д4 NH4+	ДНК олигонуклеотид, образованный четырьмя теломеными повторами и полученный упариванием в 200мМ ацетате аммония (предположительно межмолекулярный квадруплекс)
Д4 К+	ДНК олигонуклеотид, образованный четыремя теломерными повторами и полученный упариванием в 200мМ хлориде калия (предположительно внутримолекулярный квадруплекс)

Литературный обзор

Общий обзор

О механизме работы белка Est3 теломеразного комплекса дрожжей не найдено ни одного источника потому как такими исследованиями никто не занимался. Можно привести лишь некоторые вводные данные.

На концах линейных хромосом находятся специализированные структуры ДНК, называемые теломерами. Они представляют собой одноцепочечные последовательности ДНК. (ссылка)Эти последовательности стабилизируют концы хромосом, и, как предполагается, формируют структуры, называемые G-квадруплексами. (ссылка) Известно, что ДНК-полимераза не может реплицировать 3’ концы хромосом, это делает фермент теломераза. Предполагается, что один из белков теломеразы образует комплекс с G-квадруплеском, что скорее всего является подготовительной стадией для начала работы фермента по реплицированию 3’ конца хромосомы (ссылка).

Стоит отметить, что на концах хромосом могут образовываться и другие структуры. Одноцепочечная ДНК может располагаться в виде широкого кольца, стабилизированного теломерными белками. Данная структура называется Т-петлей. В конце Т-петли одноцепочечная теломерная ДНК может присоединяться к двуцепочечной, нарушая спривание цепочек в этой молекуле и образуя связи с одной из цепей. Это трехцепочечное образование называется Д-петля (ссылка).

Т еломерная днк дрожжей

Теломеры дрожжей Saccharomyces cerevisiae, характеризуются гетерогенными нерегулярными повторами, последовательность которых сокращенно можно записать как G_1-3T или G_2-3(TG)_1-6 [4, 5]. Это отличие обусловлено, по всей видимости, неточным копированием матричного участка дрожжевой теломеразной РНК (TLC1). Гетерогенные теломерные повторы являются особенностью не только теломер Saccharomyces cerevisiae, они свойственны также большинству других дрожжей рода Saccharomyces, а, корме того, многим систематически более отдаленным дрожжам, таким как Kluyveromyces lactis и Candida albicans. Необходимо также отметить, что теломерные повторы дрожжей порой могут состоять из большого числа нуклеотидов (до 26). Гетерогенность дрожжевых теломерных повторов оказалась свойством, которое удалось использовать экспериментально и с его помощью продемонстрировать, что концы дрожжевых хромосом имеют очень динамическую структуру. В процессе анализа нуклеотидных последовательностей дрожжевых теломер было обнаружено, что последние 40-100 нуклеотидов на самом конце хромосом характеризуются большой вариабельностью, проявляющейся по истечении одного или нескольких клеточных циклов. Тот факт, что эта вариабельность полностью исчезает при выключении в клетках Saccharomyces cerevisiae теломеразной активности, указывает на то, что синтез теломерных повторов идет лишь на самом крайнем участке хромосом. Причем, длинна этого участка намного больше, чем можно было бы ожидать, исходя из предположения, что теломераза компенсирует утраченные в процессе репликации нуклеотиды (3-5 за клеточный цикл). Оказалось, что теломераза действует крайне избирательно, удлиняя только самые короткие теломеры в пределах одной клетки. В заключение можно сказать, что баланс между укорочением теломеры и ее теломеразным удлинением есть процесс крайне сложный и тонкорегулируемый, все подробности которого до сих пор не ясны.