Количественное определение молочной кислоты в сыворотке крови по реакции Уффельмана
Принцип метода: молочная кислота в присутствии фенолята железа (реакция Уффельмана), окрашенного фиолетовым цветом, образует лактат железа жёлто-зелёного цвета.
порядок выполнения работы. В центрифужную пробирку вносят 2 мл сыворотки крови, добавляют 1 мл 10% ТХУ (на холоду!) для осаждения белков. Через 10 минут центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. К 1 мл центрифугата добавляют 1 мл 1% раствора фенола и 0,5 мл 1% раствора хлорида железа. Через 15 минут колориметрируют на ФЭКе (фильтр 425) против воды. Расчёт ведут по калибровочному графику.
Клинико-диагностическое значение. У здорового человека в артериальной крови содержится 0,50-1,60 мМ/л, в венозной 0,55-2,22 мМ/л молочной кислоты. содержание молочной кислоты в крови увеличивается при усиленной мышечной работе, сердечной недостаточности, пневмонии и легочной недостаточности, других видах гипоксии. Определённое значение имеет определение молочной кислоты при диагностике некоторых злокачественных заболеваний.
Контрольные вопросы
Сколько стадий включает анаэробный гликолиз ?
Какие существуют пути устранения молочной кислоты ?
Почему после выполнения одинаковой по объему физической нагрузки концентрация лактата у спортсменов ниже, чем у неспортсменов ?
На чем основан метод определения молочной кислоты в сыворотке крови по реакции Уффельмана ?
2.6. Биохимические основы функционирования аэробных путей ресинтеза аденозинтрифосфата
Аэробные пути дают на порядок большее количество энергии, чем анаэробные, однако для этого требуется кислород. Данный способ получения энергии напрямую зависит от эффективности транспортной системы доставки кислорода в ткани. Эффективное функционирование аэробных путей получения энергии в первую очередь обеспечивают такое качество как выносливость, т. е. способность выполнять умеренную продолжительную физическую работу. Это качество в первую очередь необходимо для спортсменов, тренирующихся в циклических видах спорта. В аэробных путях субстраты - глюкоза и жирные кислоты в начале превращаются в ацетил-КоА, а затем распадаются до СО2 и Н2О с образованием АТФ путем окислительного фосфорилирования в цепи переноса электронов. Для аэробного пути получения энергии имеют значение аэробный гликолиз, окисление жирных кислот и окисление глицерина.
ГЛЮКОЗА
- 2 АТФ
2-глицеральдегид-3-фосфат
4 АТФ (с.ф.)
2 НАДН · Н+ (6 АТФ)
2 Пируват
2 НАДН · Н+ (6 АТФ)
2 Ацетил-КоА
2 АТФ (с.ф.)
6 НАДН · Н+ (18 АТФ)
2 ФАДН2 (4 АТФ)
СО2 + Н2О
Итог: 38 АТФ
Схема 14. Энергетический баланс аэробного гликолиза
1.Аэробный гликолиз. В ходе аэробного гликолиза глюкоза окисляется до СО2 и Н2О с образованием 38 АТФ. Восстановленная форма кофермента - НАДН·Н+, которая образуется в 6-й реакции гликолиза при окислении 3-фосфоглицеринового альдегида не «разгружается» на пируват с образованием молочной кислоты, а челночными механизмами доставляется из цитоплазмы в митохондрии и также дает энергию в виде АТФ. Таким образом, энергетическая эффективность аэробного гликолиза в 19 раз больше анаэробного.
2. Окисление жирных кислот.
Г
ормон
рецептор модифицированный
рецептор
неактивная активная
аденилатциклаза аденилатциклаза
АТФ ц АМФ
неактивная активная
протетнкиназа протеинкиназа
неактивная активная
липаза липаза
ТАГ ДАГ + ЖК
МАГ + ЖК
ГЛ + ЖК
Схема 15. Липолитический каскад Стайнберга
Источником жирных кислот и глицерина являются триацилглицеролы (ТАГ) жировых отложений. Процесс мобилизации ТАГ из жировых депо носит названия липолиза и осуществляется внутриклеточными липазами. Активация внутриклеточных липаз носит название липолитический каскад Стайнберга (схема 15). В ходе липолиза образуются глицерин и жирные кислоты. Глицерин хорошо растворим в воде, поэтому переносится кровью в растворенном состоянии, а свободные жирные кислоты переносятся альбуминами плазмы крови. Процесс извлечения энергии из жирных кислот носит название в-окисление или по имени авторов внесших наибольший вклад в изучение данного процесса - цикл Кноопа-Линена. Процесс в-окисления протекает в 3 стадии.
1 стадия. Активация жирных кислот. Происходит в цитоплазме. Реакция заключается во взаимодействии жирной кислоты (ацила) с коферментом А, с образованием ацил-КоА.
O O
║ Ацил-КоА-синтетаза (тиокиназа) ║
R
- C - OH + КоА
R - C - S KoA
АТФ АМФ+ ФФн
Схема 16. Активации жирной кислоты в цитоплазме клеток
Процесс в-окисления протекает в матриксе митохондрий, а образовавшийся ацил-КоА не проходит через внутреннюю мембрану митохондрий. Данная проблема решается путем функционирования специального переносчика - карнитина. Карнитин синтезируется из лизина и метионина в печени и почках (схема 17). Особенно много его в мышцах.
(CH3)3+N - CH2 - CHOH - CH2 - COOH
Схема 17. Химическое строение карнитина (гамма-триметиламино- в--гидроксибутират)
При действии карнитин-ацилтрансферазы к спиртовой группе карнитина присоединяется жирная кислота (сложноэфирной связью):
Ацил-SКоА + Карнитин Ацилкарнитин + НSКоА. Ацилкарнитин может диффундировать в митохондрию.
Цитоплазма Мембрана митохондрий Матрикс
O
O
║ ║
R
- C - SKoA
HO - Карнитин
HO - Карнитин
R - C - SKoA
O O
║ ║
KoASH R - C - O - Карнитин R - C - O - Карнитин KoASH
Схема 18. Участие карнитина в транспорте ацил-КоА
2 стадия. в-окисление жирных кислот. Протекает в матриксе митохондрий.
O
║
R - CH2 - CH2 - C ~ SKoA ацил-КоА
ФАД ацил-КоА-дегидрогеназа
ФАДН2
O
║
R - CH = CH - C ~ SKoA еноил-КоА
Н2О еноил-КоА-гидратаза
O
║
R - CH - CH2 - C ~ SKoA в-гидроксиацил-КоА
│
OH НАД+ в-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназа
НАДН · Н+
O
║
R - C - CH2 - C ~ SKoA в-кетоацил-КоА
║
O КоА SH тиолаза
O O
║ ║
H3C - C ~ SKoA R - C ~ SKoA (n -2)
Схема 19. в-окисления жирных кислот в митохондриях
Таким образом, жирная кислота с четным числом атомов углерода в ходе в-окисления распадается на ацетил-КоА. При этом в каждом цикле образуются восстановленные формы коферментов - ФАДН2 и НАДН·Н+, которые вступают в цепь переноса электронов и дают 2 и 3 молекулы АТФ соответственно.
3 стадия. Цикл трикарбоновых кислот. В ходе данного метаболического пути происходит окончательное окисление молекулы ацетил-КоА до СО2 и Н2О с образованием 12 молекул АТФ.