- •Вопросы для подготовки к коллоквиуму № 1
- •По разделам «Методы изучения живого. Организация живого» и «Генетический материал. Структура и функции»
- •1. Уровни организации и свойства живого.
- •6. Транспорт веществ через клеточную мембрану.
- •9. Химический состав клетки (неорганические и органические вещества, их роль в жизнедеятельности клетки).
- •13.Сравните строение нуклеотидов днк и рнк.
- •14. Первичная и вторичная структуры днк. Модель днк Уотсона и Крика. Правила Чаргаффа.
- •15. Формы двойных спиралей днк, их характеристика.
- •25. Синтез ведущей и отстающей цепей днк.
- •33. Мутагены (определение, классификация, примеры).
- •34. Генные мутации. Классификация генных мутаций.
- •35. Молекулярные механизмы возникновения генных мутаций
- •36. Хромосомные мутации (определение, классификация, механизмы возникновения).
- •37. Геномные мутации (определение, классификация, механизмы возникновения).
25. Синтез ведущей и отстающей цепей днк.
Инициация. Подготовка ДНК матрицы. Точки начала репликации на молекуле ДНК – ori-сайт - имеют специфическую последовательность оснований, богатую парами А-Т. Процесс начинается с того, что с каждой такой последовательностью связываются несколько молекул специальных узнающих белков (у прокариот это белки DnaA). Далее геликаза осуществляет денатурацию ДНК, а топоизомеразы снимают напряжение еще не раскрученной ДНК. SSb-белки с свою очередь препятствуют обратной ренатурации ДНК.
Элонгация. Синтез ДНК цепей. Репликационная вилка разделяется на отстающую цепь и лидирующую. Т.к ДНК-полимераза может работать только направлении 5'3', то на лидирующей цепи синтез идет непрерывно. Отстающая цепь образуется в виде фрагментов Оказаки. ДНК-полимераза III доходит до РНК-затравки предыдущего фрагмента Оказаки и отделяется. Ей на смену приходит ДНК-полимераза I, которая осуществляет последовательное отщепление нуклеотидов с 5’-конца РНК-затравки предшествующего фрагмента.
Терминация. Окончание синтеза. ДНК-лигаза соединяет фрагменты Оказаки, а гираза закручивает цепочки ДНК в спираль. РНК-полимераза I (прокариот), (РНКазаН у эукариот) - удаляет РНК-праймеры. Теломераза достраивает теломерные участки хромосом эукариот.
25. Сравните процесс репликации у прокариот и эукариот.
- у эукариот репликация идет в S-период митотического цикла в ядре и ДНК содержащих органоидах.
- ДНК полимеразы различны
- молекула ДНК у эукариот – полирепликон. У прокариот – монорепликон.
- скорость репликации у эукариот 50нукл. в сек. у прокариот – 500нукл. в сек.
- длина фрагментов Оказаки у эукариот – 100-200пар нукл., у прокариот – 1000-2000 пар нуклеотидов.
- у эукариот присутствует проблема недореплицированности. Наличие теломер решает проблему недореплицированности концов линейных молекул. (у прокариот кольцевая молекула)
26. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Условия проведения ПЦР. Этапы процесса.
ПЦР – молекулярный генетический метод получения in vitro большого количества копий определенного фрагмента ДНК.
Условия проведения ПЦР:
- R-праймаза. ДНК-праймер. 1мкл
- L-праймаза. ДНК-праймер. 1мкл
- dNTP (дезоксирибонуклеотидтрифосфат) – 5мкл
- буферный раствор 10 мкл
- дистиллированная вода 22 мкл
- ДНК-матрица 10мкл
- Taq – полимераза 1мкл
Итого: 50 мкл
Смесь помещают в амплификатор на 1.5-2 часа.
Этапы процесса:
1 этап: Денатурация ДНК. Протекает при 93-94°С в течение 30-40 сек. Происходит разрушение водородных связей.
2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах соответствующего участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65 градусов. Время отжига 20-60 сек.
3 эпап: Достраивание цепи (элонгация). Комплементарное достраивание цепей происходит от 5’-конца к 3’-концу в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей служат добавляемые в раствор нуклеотиды. Синтез происходит при температуре 70-72 С, время синтеза – 20-40 сек. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для нового цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n- число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась всего одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.
27. Составьте схему амплификации фрагмента ДНК с помощью ПЦР.
28. Детекция результатов ПЦР.
После амплификации ДНК-фрагмента с помощью ПЦР, фрагмент гидролизуют подходящей рестриктазой. Фрагменты разделяют гель –электрофорезом, а интересующий фрагмент выделяют с помощью специфичного генного зонда.
Генный зонд – это молекулы ДНК или РНК, меченные радиоактивными изотопами.
29. Области применения ПЦР.
Клиническая лабораторная диагностика
• диагностика вирусных инфекций (ВИЧ, гепатит, половые инфекции и др.)
• определение отцовства
• диагностика генных болезней (выявление мутаций)
• судебная медицина (напр. идентификация личности)
Фундаментальная наука и практика
• секвенирование (определение нуклеотидной последовательности, меченые атомы)
• клонирование генов
• генная инженерия (создание трансгенных животных и растений)
• генная терапия
• направленный мутагенез
30. Изменчивость как свойство живых организмов. Классификация изменчивости. Биологическое значение изменчивости.
Изменчивость - разнообразие признаков среди представителей данного вида, также свойство потомков отличаться от родительских форм.
Классификация изменчивости:
1. Модификационная или фенотипическая изменчивость. Охватывает изменения признаков, которые происходят под влиянием условий развития или факторов внешней среды. Является ненаследственной.
Характеризуется следующими особенностями:
- развитие в сходных условиях носит групповой характер проявления признака.
- изменчивость носит обратимый характер.
- влияние среды может изменить проявления признаков на основе наследственного проявления нормы реакции. Норма реакции – свойство данного генотипа обеспечивать в определенных пределах развитие данного онтогенеза в зависимости от меняющихся условий внешней среды.
2. Комбинативная изменчивость. Изменчивость, которая возникает вследствие рекомбинации генов во время слияния гамет. Является наследственной.
- независимое расхождение хромосом во время мейоза;
- случайная встреча половых гамет, а вследствие этого и сочетания хромосом во время оплодотворения;
- рекомбинация генов вследствие кроссинговера.
3. Мутационная изменчивость. Изменчивость, вызванная действием на организм мутагенов, вследствие чего возникают мутации (реорганизация репродуктивных структур клетки). Мутагены бывают физические (радиационное излучение), химические (гербициды) и биологические (вирусы).
Фенотипическая изменчивость является главным фактором приспособления организмов к изменяющимся условиям внешней среды.
Наследственная изменчивость поставляет материал для эволюционного процесса.
31. Комбинативная изменчивость. Механизмы возникновения. Рекон.
Комбинативная изменчивость – изменчивость, которая возникает вследствие рекомбинации генов во время слияния гамет. Является наследственной.
Механизмы возникновения:
- независимое расхождение хромосом во время мейоза;
- случайная встреча половых гамет, а вследствие этого и сочетания хромосом во время оплодотворения;
- рекомбинация генов вследствие кроссинговера.
Рекон - элементарная единица генетической рекомбинации, или минимальное расстояние между двумя точками хромосомы, в пределах которых возможна рекомбинация. Термин введён в 1957 американским генетиком С. Бензером.
32. Мутации. Мутон. Классификация мутаций.
Мутация - изменение генотипа, происходящее под влиянием внешней или внутренней среды. Термин предложен Гуго де Фризом. Процесс возникновения мутаций получил название мутагенеза.
Мутон – наименьший участок ДНК, изменение которого приводит к мутации.
Классификация мутаций:
В зависимости от размера поврежденного участка ДНК выделяют генные, хромосомные и геномные мутации. По локализации в клетке – соматические и генеративные (наследственные мутации, которые переходят в сегрегационный груз). Полезные мутации, вредные или нейтральные (оценивает естественный отбор).
Мутации также делятся на спонтанные и индуцированные. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно на протяжении всей жизни организма в нормальных для него условиях окружающей среды с частотой около 10−9 — 10− 12 на нуклеотид за клеточную генерацию.
Индуцированными мутациями называют наследуемые изменения генома, возникающие в результате тех или иных мутагенных воздействий в искусственных (экспериментальных) условиях или при неблагоприятных воздействиях окружающей среды.